ITS-nrDNA 片段分析確認安妮塊菌Tuber anniae 是泛北極分布物種

劉虹，李素玲，李婷，郭尚

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 山西功能食品研究院 山西 太原 030031；2.首都師范大學 生命科學學院，北京 100048）

2015 年8 月至2017 年9 月，在中國北部河北省霧靈山地區(qū)和山西省呂梁山脈的中北部地區(qū)調(diào)查當?shù)販貛謪^(qū)地下真菌物種多樣性時，采集到部分塊菌菌根樣本和一種白色的塊菌子囊果，經(jīng)鑒定為原產(chǎn)于美國的安妮塊菌Tuber anniaeW.Colgan&Trappe［1-2］。塊 菌 屬 物 種分布 表 現(xiàn) 為 高度的洲際特有化，目前基于現(xiàn)代分子系統(tǒng)學基礎(chǔ)上的塊菌物種在自然界還沒有同時分布在兩個大洲的記錄，之前許多歐洲種或北美種在亞洲或其它大洲的分布報告均被近期研究證實或源于標本的錯誤鑒定［3］，或由于人類在洲際間引種樹木等行為隨共生樹木被動帶入，或由人工種植主動引入［4］。安妮塊菌是第1 個被現(xiàn)代分子系統(tǒng)學證實的間斷分布于2 個大洲以上、均可與當?shù)乇就翗浞N共生的塊菌屬物種。深入分析安妮塊菌，對進一步研究塊菌屬Tuber的起源演化、生物地理、種群傳播乃至引種馴化等方面具有重要參考意義。

本研究以中國樣本為基礎(chǔ)，結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫和相關(guān)研究采用的分子數(shù)據(jù)，對安妮塊菌在中國的形態(tài)學特征及其變化特點、全球地理分布、共生樹種等方面進行分析，為菌根食用菌開發(fā)、名貴商業(yè)塊菌品種的引進以及森林生態(tài)經(jīng)濟模型的建立等方面提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌根采集

本研究所用樣本于2015 年8 月從離目標樹木華北落葉松Larix principis-rupprechtiiMayr 和油松Pinus tabulaeformisCarr. 周邊1～2 m 處，挖取15 cm×15 cm×10 cm 左右大小的土塊，從中撿出小的細根，挑選表面有菌根樣的根尖部位，用自來水將表面泥土沖洗去除，分類包好。將上述樣本放置在4 ℃下冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫鎯r間不得超過7 d。

1.1.2 子囊果采集

本研究依據(jù)的子囊果于2016 年10 月采自中國河北省東北部霧靈山和2017 年9 月采自山西省呂梁山脈中北部的華北落葉松Larix principis-rupprechtiiMayr 樹下土壤中。新鮮的子囊果標本經(jīng)45 ℃烘干后保存于首都師范大學標本館（BJTC）。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學鑒定

對子囊果的宏觀特征在體視顯微鏡下進行觀察和描述，主要包括子囊果的形狀、大小、顏色、基部是否具凹陷、子囊果表面有無毛、光滑、具疣或具瘤、產(chǎn)孢組織顏色、菌脈的類型等。子囊果的顯微結(jié)構(gòu)特征觀察在光學顯微鏡下進行。首先采用手術(shù)刀進行徒手切片，以蒸餾水、3%KOH 作為浮載劑制作水封片。觀察、測量與記錄的項目主要包括子囊果包被的厚度、組織類型，包被表面毛狀菌絲的形狀、長度和寬度，子囊的形狀、大小、子囊孢子的數(shù)目，子囊孢子的形狀、大小、顏色、表面紋飾的類型、紋飾的高度等。

1.2.2 DNA 序列測定和比對

DNA 提 取、PCR 以 及 序 列 測 定 參 照Fan 和Huang［3，5］方 法，DNA 提 取 采 用 改 良 過 的CTAB 方法提取擔子果總DNA 后，擴增核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）片段，PCR 擴 增 引 物 為ITS1-F/ITS4（Gardes & Brun 1993）［6］，ITS 的 擴 增 條 件 為：94 ℃預(yù) 變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；將PCR 產(chǎn)物送至北京中科西林生物技術(shù)有限公司（中國北京）進行純化、測序和編輯，將序列提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi（nlm.nih.gov/.）檢索獲取相似性較高的同源序列，與本研究自測序列相似度高于95%的序列匯總（表1）。

表1 本研究用樣品名稱、來源ITS 序列登錄號Table 1 Scientific name，locality and ITS sequence information of the samples in this study

系統(tǒng)發(fā)育樹的建立和分析參見Fan 和Huang［3，5］方 法。采 用ITS 序 列 數(shù)據(jù)集將供試標本序列于GenBank 中進行Blast 比對，用EditSeq 軟件將供試標本序列和從GenBank 下載的序列進行比對，用Gblocks（http：//molevol. cmima. csic. es/castresana/Gblocks_server. html）在線剪切軟件進行剪切以及用Se-Al v.2.0［7］手工調(diào)整。以最大簡約 法（Maximum parsimony， MP）用 PAUP*4.0b10.［8］構(gòu) 建MP 樹，采 用Clustal X 軟件對各基因的序列進行比對；自舉檢驗1000 次，分析獲得的支 持 度。用TreeView32［9］查看樹的 拓 撲 結(jié) 構(gòu)，支持值大于70（MPBS≥70%）視為可靠的支持值。

續(xù)表

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究共采用61 條nrDNA-ITS 序列，其中7條為中國樣本，其余54 條下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫。2條太平洋塊菌Tuber pacificumTrappe，Castellano& Bushnell 和1 條來自美國的Tubersp. 的序列被選作分析用外類群?；贗TS 序列的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）顯示所有內(nèi)類群聚為在一支并獲得100%的支持，這一大支進一步可以識別出3 個亞支，分別標注為A 亞支、B 亞支和C 亞支。其中B亞支自舉值較高（BP=95%），A 亞支和C 亞支沒有得到支持（圖1）。A 亞支由34 條來自亞洲（包括2 條來自中國山西的序列）、歐洲和北美洲的序列組成；B 亞支的13 條序列來自亞洲（包括5 條來自中國河北和1 條日本序列）、歐洲和北美洲；C 亞支有10 條歐洲和北美洲的序列，包括來自安妮塊菌Tuber anniae模式標本的序列（HM485338），另外有1 條序列（EF218844）在A 亞支附近，但沒有支持值。BLAST 比對分析顯示A 亞支序列間的ITS 相似度為98.9%～100%，B 亞支內(nèi)序列間相似度為98.9%～100%，C 亞支內(nèi)序列間相似度為99.5%～100%。相對而言，A 亞支和B 亞支之間ITS 序列相似度為98.4%～99.3%，B 亞支和C 亞支之間為97.2%～97.9%，A 亞支和C 亞支之間為97.0%～98.2%。

圖1 基于nrDNA-ITS 基因片段的安妮塊菌系統(tǒng)發(fā)育樹（ML）Fig.1 Phylogenetic tree（ML）for Tuber anniae based on nrDNA-ITS sequences

2.2 分類學結(jié)果

基于中國標本的形態(tài)特征描述：子囊果近球形或不規(guī)則塊狀，直徑0.8～2.2 cm，新鮮時白色或近白色，老熟后土褐色，表面平坦，光滑，偶爾部分區(qū)域有淺溝。孢體幼時白色，以后逐漸褐色，完全成熟時為暗灰褐色，切面觀有大理石樣白色脈紋，老熟后脈紋不再明顯。氣味清淡，味道沒有記錄。包被組織厚150～200 μm，分為2 層；外層為擬薄壁組織，由近球形或不規(guī)則的菌絲膨大細胞組成，細胞直徑5～25 μm，薄壁或微微增厚到1～1.5 μm；內(nèi)層為菌絲交織組織，菌絲無色，薄壁，直徑2.5～5 μm，分隔，分支。子囊球形、近球形、卵圓形或梨形，60～85 μm×55～70 μm，無色，薄壁，內(nèi)生1～4 個子囊孢子，多數(shù)無柄，偶爾具一短柄。子囊孢子廣橢圓至近球形，成熟后褐色至暗褐色，表面具有網(wǎng)格狀紋飾，25～45 μm×20～40 μm（不包括紋飾），通常孢子表面橫向有3～5 個網(wǎng)格。

標本研究：中國：河北省興隆縣霧靈山，北緯40°35′，東經(jīng)117°28′，海拔1801 m，華北落葉松Larix principis-rupprechtiiMayr 樹下土壤中，2016年10 月10 日，李 婷LT001（BJTC FAN640）；中國：河北省興隆縣霧靈山，閆向遠YXY024（BJTC FAN644）；同上YXY023（BJTC FAN648）。山西省關(guān)帝山，北緯37°50′，華北落葉松樹下土壤中，2017 年9 月7 日，李婷LT001（BJTC FAN818）；山西省關(guān)帝山，閆向遠YXY024（BJTC FAN875）。

3 討論

3.1 形態(tài)學討論

本研究發(fā)現(xiàn)的中國標本與美國的安妮塊菌模式標本之間的形態(tài)學差異主要表現(xiàn)在兩個方面，一是子囊孢子形狀，二是子囊果顏色。據(jù)原始作者發(fā)表該物種時的原始描述，其子囊孢子為球形、近球形或廣橢圓形［1］，而中國的標本為廣橢圓形至近球形。根據(jù)我們多年來對塊菌屬物種標本的形態(tài)學鑒定觀察，塊菌屬物種的孢子形狀的穩(wěn)定性依不同物種而不同，有些物種其孢子形狀非常穩(wěn)定，如金沙江塊菌Tuber jinshajiangL. Fan 和石氏塊菌T. shiiL. Fan&Y.W. Wang 這對姊妹種，它們之間形態(tài)學方面的唯一區(qū)別可能就是它們的子囊孢子形狀，即金沙江塊菌孢子是正球形，而石氏塊菌為球形至近球形，這樣的例子尚有歐洲的姊妹種T. sphaerospermum和T. oligospermum之間的形態(tài)學差別［10］。而在另一些物種中，子囊孢子的形狀會依不同的個體或不同產(chǎn)地而有所不同，如中國西南地區(qū)的常見塊菌闊孢塊菌Tuber latisporumJ. Chen&P. G. Liu，其子囊孢子形狀在一些子囊果中是典型的廣橢圓形，而在另一些個體中其形狀可能會是典型的近球形或以近球形為主，但DNA 分析結(jié)果為同一物種。對安妮塊菌而言，本研究認為其孢子變化規(guī)律與中國的闊孢塊菌類似。關(guān)于子囊果的顏色，中國的標本為白色或局部有些土褐色，歐洲標本與中國的相似，然而，模式標本的原始描述為暗綠褐色［1］，這與中國和歐洲的標本明顯不同。這一點讓我們想起在幾個中國特有塊菌物種中觀察到的一些特別的顏色現(xiàn)象，如曹氏塊菌Tuber caoiL. Fan，正常的顏色為淺淺的灰綠色或灰褐色帶有較明顯的橄欖綠色調(diào)，但是我們從中也發(fā)現(xiàn)過暗紅褐色的個體；同樣，在黃綠色的光巨孢塊菌Tuber glabrumL. Fan& S. Feng 子囊果中，經(jīng)?？梢园l(fā)現(xiàn)近乎黑色的個體；同樣的情況也出現(xiàn)在闊孢塊菌中T. latisporum，據(jù)此推測美國的那份模式標本極有可能成熟過度或者顏色異常，否則無法解釋ITS 片段的在種一級水平如此高度相似。另外，根據(jù)對中國塊菌屬Tuber物種的觀察，安妮塊菌所屬的塊菌屬短毛塊菌譜系（Puberulumlineage）的物種大多數(shù)種類其孢體顏色較淺，山西發(fā)現(xiàn)的安妮塊菌孢體顏色為褐色，而河北采到的安妮塊菌孢體顏色成熟時是深褐色（咖啡色），類似于歐洲的波氏塊菌Tuber borchii。芬蘭的標本形態(tài)描述孢體為淺褐色，但根據(jù)其子囊及子囊孢子照片［11］，可以判斷這些描述明顯來自未成熟的子囊果，即安妮塊菌Tuber anniae。

圖2 安妮塊菌成熟子囊果（左圖：山西標本，右圖：河北標本）Fig.2 Ascomata of Tuber anniae ：Shanxi sample（Left），Hebei sample（Right）

圖3 安妮塊菌顯微鏡孢子廣橢圓形至近球形Fig.3 Ascomata of Tuber anniae

3.2 安妮塊菌Tuber anniae 的物種確定

安妮塊菌最早發(fā)現(xiàn)于美國西北部太平洋沿岸的本土樹種Pseudotsuga menziesii（Mirb.）Franco樹下土壤中［1］，這個物種發(fā)表后并沒有引起人們太多的注意。2013 年，在北歐芬蘭的Pinus sylvestris樹下采到了一些白色的塊菌［11］，并將這些塊菌與GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的DNA 序列進行了比對分析研究。共采用了24 條有關(guān)的ITS 片段來進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示這些密切相關(guān)的DNA 序列聚成了一個自舉值很高的大支，這個大支內(nèi)進一步可以分成3 個有較高自舉值的亞支，這3 個亞支被作者定義為安妮塊菌復(fù)合種Tuber anniaecomplex［11］。這個觀點被后來的一些學者所接受［12-13］。本研究中，共收集了包括7 條中國自測序列在內(nèi)的來自全球范圍內(nèi)的58 條相關(guān)序列，基于nrDNAITS 片段的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹顯示所有內(nèi)類群聚為在一支并獲得100%的支持。這些序列也可以進一步識別為A、B、C 等3 個亞支，這3 個亞支基本上對應(yīng)于［11］的cladesI、II、III。BLAST 分析顯示，本研究的這3 個亞支內(nèi)的ITS 相似度分別為98.9%～100%、98.9%～100%和99.5%～100%，而3 個亞支之間的ITS 相似度分別為98.4%～99.3%、97.2%～97.9% 和97.0%～98.2%，其中，A 亞支中來自中國山西的2 條序列和C 亞支中的安妮塊菌模式種序列相似度高達99%，這些數(shù)值均遠高于美國學者［14］和日本學者［15］基于大量數(shù)據(jù)分析提出的96%或95%的塊菌屬物種界定的ITS 相似度值。另一方面，本研究分析的ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹的3 個亞支中，A、B 兩個亞支的樣本都來自北美洲、歐洲和亞洲，C 亞支由來自歐洲和北美洲的樣本組成，這說明它們彼此之間沒有特定的地理對應(yīng)現(xiàn)象，因而從生物地理角度也不能支持這3 個亞支為不同的塊菌物種。

3.3 安妮塊菌的共生樹種及其在自然界的分布

近年的研究表明塊菌屬Tuber在種一級水平上表現(xiàn)出高度的洲際特有現(xiàn)象［16］，過去幾十年來所有在中國的歐美種類報道被證實均源于標本的錯誤鑒定［3］。據(jù)悉，到目前為止安妮塊菌Tuber anniae是唯一有DNA 數(shù)據(jù)支持的歐、亞、北美3 個大陸共有的塊菌屬物種。在北美洲，安妮塊菌最早在美國西北部太平洋沿岸地區(qū)的本土樹種Pseudotsuga menziesii樹下土壤中發(fā)現(xiàn)，最近采用DNA技術(shù)在美國東部馬薩諸塞州Arnold 植物園引進的歐洲松Pinus nigra根部探測到了它的存在［11］，此外，在Alaska 和Nebraska 也 發(fā)現(xiàn)了它的 分 布［13］。在加拿大東部和西部，尤其在British Columbia，這個物種被證實為當?shù)爻Ｒ姷膲K菌屬物種［13］。在歐洲的波羅的海周邊地區(qū)，從樹木根尖提取的DNA片段證實了安妮塊菌在芬蘭、愛沙尼亞［10-11］和拉脫維亞（本文）的存在，但僅在芬蘭從Pinus sylvestris樹下土壤中采到了子囊果［11］。在亞洲的日本，一條來自北海道亞洲本土樹種Betula ermanii根尖提取的ITS 序列（AB669507）比對到了這個物種。在中國，安妮塊菌在兩個中國本土的森林建群樹種華北落葉松Larix principis-rupprechtii和油松Pinus tabulaeformis的根尖上檢測到了其存在，在華北落葉松下發(fā)現(xiàn)其子實體。作者初步調(diào)查了本物種發(fā)現(xiàn)地河北霧靈山和山西呂梁山產(chǎn)地周邊及附近的生物環(huán)境，沒有發(fā)現(xiàn)有大型植物園一類的可能導(dǎo)致外來植物人為引進的場所，也沒有查閱到河北霧靈山和山西呂梁山有引進歐美樹種的歷史文件記錄，也就是說沒有發(fā)現(xiàn)這個和樹木形成外生菌根的塊菌物種意外或間接被引入該地區(qū)的可能因素存在，因此推斷這個塊菌物種應(yīng)該是自然分布到本區(qū)域的。雖然近來安妮塊菌在新西蘭松林內(nèi)被探測到，但它生長在從歐洲引進的外來樹種形成的人工林內(nèi)，據(jù)此推測這個物種在南半球的分布可能源于人類從北半球引種樹木的結(jié)果［11-12］。進一步的地理分布分析揭示，這個物種明顯傾向于高緯度地區(qū)。在北美洲，安妮塊菌均見于美國和加拿大的北部地區(qū)；在歐洲，北部的波羅的海周邊可能是它在歐洲的分布中心；在亞洲的日本，只發(fā)現(xiàn)于北海道一地；而在中國，僅在北方的河北霧靈山和山西呂梁山脈中北部的高海拔地區(qū)發(fā)現(xiàn)其分布。就目前數(shù)據(jù)而言，本種分布最北部的記錄是北緯61°35′，位于芬蘭［11］，中國呂梁山脈中部關(guān)帝山的發(fā)現(xiàn)地位于北緯37°50′，可能是本種已知分布的最南端。菌根研究證實，安妮塊菌能夠與多種樹木共生形成菌根，其范圍包括裸子植物（如Pinus sylvestris，Larix principis-rupprechtii等）和被子植物（如Pseudotsuga menziesii，Betula ermanii等），既可以是本土樹種，也可以是外來樹種［11-13］。安妮塊菌能夠在自然界多種不同的土壤［11-13］中產(chǎn)生子囊果證明其有很強的環(huán)境適應(yīng)能力，這在一定程度上解釋了它在自然界廣泛的地理分布。

4 結(jié)論

本研究確認了分布于歐洲、北美洲、亞洲高緯度或高山地區(qū)的安妮塊菌復(fù)合種Tuber anniae complex屬于同一個物種。安妮塊菌在自然界間斷分布于北美洲、歐洲和亞洲，可與多種樹木形成外生菌根，廣泛分布于北半球高緯度或高山地區(qū)，是一個泛北極分布的塊菌屬物種。對于塊菌屬這一在洲際間物種高度特有化的地下菌類群而言，安妮塊菌對解釋塊菌屬物種在全球范圍內(nèi)的起源演化以及生物地理等方面研究有重要意義。此外，安妮塊菌是一種有潛在經(jīng)濟價值的食用真菌，其子囊果成熟后香氣濃郁，類似于歐洲的波氏塊菌Tuber borchii（僅次于意大利白塊菌T. magnatum的著名品種），商業(yè)上屬于在國際市場上廣受歡迎的“白松露”之一種。它在中國北方的發(fā)現(xiàn)，尤其是它和油松這一北方溫帶干旱地區(qū)重要造林樹種能形成外生菌根的事實為我們下一步的植樹造林、菌根食用菌開發(fā)、名貴商業(yè)塊菌品種的引進以及森林生態(tài)經(jīng)濟模型的建立等方面提供了一個新的思路和方向。