子囊霉素生物合成的研究進展

宋柯璟，齊海山，聞建平

子囊霉素(ascomycin，F(xiàn)K520)，由聚酮合酶-非核糖體合成酶共同合成，是具有高效的抗真菌和免疫抑制活性的天然化合物。子囊霉素作為抗真菌的抗生素，還具有免疫抑制特性，近年來被成功用于預(yù)防器官移植排異，并且在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等方面的治療也有顯著功效。子囊霉素除了在治療自身免疫疾病中有不錯的療效，還具有抗痙攣、抗瘧疾、神經(jīng)保護再生等活性［1］，有巨大的藥用和市場價值。目前，我國對子囊霉素的相關(guān)研究還正處于發(fā)展階段，獲得具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)子囊霉素的工程菌株和發(fā)酵技術(shù)迫在眉睫。

本論文主要對子囊霉素的理化性質(zhì)與免疫抑制活性、生物合成基因簇、子囊霉素合成前體以及發(fā)酵法生產(chǎn)子囊霉素等方面進行了綜述，同時對子囊霉素的研究開發(fā)進行了展望。

1　子囊霉素的理化性質(zhì)與免疫抑制活性

子囊霉素(ascomycin，F(xiàn)K-520)是23元大環(huán)內(nèi)酯類化合物。子囊霉素的化學(xué)名為17α-乙基-1β，14α-二羥基-12β［2-(4α-羥基-3β-甲氧基-1β-1-(E)-甲基乙烯基)］-23α，25β-二甲氧基-13α，19，21α，27β-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)［22，3，1，O］二十八碳-18-2，3，10，16-四酮，一水合物，相對分子質(zhì)量為 822.5，分子式 C44H69NO12·H2O［2］，其化學(xué)式結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1　子囊霉素結(jié)構(gòu)式［2］Fig．1　Structure of ascomycin［2］

子囊霉素屬于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，主要是通過阻斷白細胞介素-2(interleukin-2)等細胞因子的表達從而抑制T淋巴細胞的免疫活性。研究表明子囊霉素分為結(jié)合域和效應(yīng)域2個域:結(jié)合域是C24-C15，與FKBP-12(FK結(jié)合蛋白12，免疫親和蛋白12)有高親和力的作用，效應(yīng)域是C13-C23，主要作用于鈣調(diào)磷酸酶的靶點。子囊霉素與免疫親和蛋白FKBP-12結(jié)合后，再與鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合形成子囊霉素-FKBP-12-鈣調(diào)磷酸酶組成的三元復(fù)合物，形成的三元復(fù)合物能夠抑制鈣調(diào)磷酸酶的脫磷酸化，鈣調(diào)磷酸酶脫磷酸化作用的抑制將直接導(dǎo)致其活性受阻。鈣調(diào)磷酸酶的脫磷酸化作用是活化T細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-AT脫磷酸化和轉(zhuǎn)移作用必須的。而NT-AT會啟動轉(zhuǎn)錄基因形成淋巴因子，如白細胞介素-2(IL-2)，從而阻止了胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，其生物學(xué)效應(yīng)是由阻礙炎癥細胞因子形成的［3］。相比于環(huán)孢菌素A(CsA)，子囊霉素對IL-2的抑制作用更強。子囊霉素還可以通過抑制神經(jīng)堿磷酸酯酶，從而抑制人類中性粒細胞中的IL-8形成。子囊霉素對IL-8的抑制生長能力比CsA要強10倍［4］，而西羅莫司則沒這種抑制功能。

2　子囊霉素生物合成基因簇的研究進展

2000年，Wu等［5］克隆并分析了 Streptomyces hygroscopicus var．a(chǎn)scomyceticus(ATCC 14891)的子囊霉素生物合成基因簇，F(xiàn)K520合成基因簇的結(jié)構(gòu)與功能如圖2所示。

圖2　子囊霉素生物合成基因簇的組成Fig．2　The composition of gene cluster of biosynthesis of ascomycin

子囊霉素作為聚酮-聚肽雜合的天然產(chǎn)物，由PKS/NRPS共同合成，其骨架結(jié)構(gòu)是由3個PKS(分別由結(jié)構(gòu)基因fkb B、fkb C、fkb A編碼)和1個NRPS(基因fkb P編碼)催化形成［6］。子囊霉素合成基因簇長達77 357 bp，其中 fkb B、fkb C、fkb A 3個大片段結(jié)構(gòu)基因分別編碼PKS的FkbB、FkbC、FkbA 3個多肽。fkb P編碼的蛋白FkbP可以將L-哌啶酸分子合并到聚酮鏈上，F(xiàn)kbP含有的C1-A-PCP-C2功能域通過特殊的酰胺鍵向FK520的骨架中引入1個非蛋白組成的氨基酸，C2功能域在C-1位和C-26位間形成C—O內(nèi)酯鍵，進行骨架組裝的最后解離和環(huán)化步驟［7］。fkb O編碼的FkbO則負責(zé)PKS起始單元的合成。

子囊霉素骨架形成的基本過程:FkbB由莽草酸衍生物作為起始單位，添加4個延伸模塊;第2個多肽FkbC和第3個多肽FkbA分別添加2個和4個延伸模塊。每個延伸模塊再分別與1個特定的延伸單位進行特定的β-酮步驟，然后再把合成鏈延伸到下1個延伸模塊上。經(jīng)PKS復(fù)合物結(jié)合的FkbP肽鏈合成酶的催化作用，中間體與哌啶酸的氮原子發(fā)生縮合反應(yīng)。與PKS復(fù)合物解除后，前體的第9位碳原子被FkbD羥基化，再被FkbO氧化，而產(chǎn)生β-羰基酰胺作用，同時31位碳上的羥基被FkbM甲基化［8］。經(jīng)過以上系列反應(yīng)后，聚酮-聚肽長鏈從PKS-NRPS組裝鏈上脫離下來，再經(jīng)過環(huán)化作用得到FK520骨架。

通過對FK520生物合成基因簇序列進行生物信息學(xué)分析，獲得了可能的特異調(diào)控基因fkb R1、fkb R2、fkb N。其中，fkb R1、fkb R2編碼的產(chǎn)物分別與LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子和以單胺氧化酶調(diào)控蛋白為代表的蛋白家族密切相關(guān)，fkb N編碼的蛋白是LuxR家族的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。fkb R和fkb N基因已被證實是FK506生物合成基因簇上與FK506合成相關(guān)的2個正調(diào)控基因［9］。目前，本課題組正在研究子囊霉素合成基因簇上相關(guān)的特異調(diào)控基因?qū)ι锖铣勺幽颐顾氐恼{(diào)控作用。此外，基因簇上還有一些與途徑特異性前體合成相關(guān)的基因，如編碼甲氧基丙二酰-ACP的基因fkb GHIJK和編碼乙基丙二酰CoA的基因fkb U、fkb E、fkb S等，在下面的子囊霉素合成前體部分將進行相關(guān)敘述。

3　子囊霉素合成前體的研究進展

用于組裝子囊霉素骨架的雜合PKS-NRPS系統(tǒng)能夠識別12分子的前體，除了2分子的丙二酰輔酶A和5分子的甲基丙二酰輔酶A外［10］，還可以識別1 分子的 4，5-二羥基-1-烯-環(huán)己酸(DHCHC)、2 分子的甲氧基丙二酰ACP、1分子的乙基丙二酰CoA和1分子的L-哌啶甲酸，如圖3所示。

正是由于這些特異性前體，子囊霉素具備了獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及優(yōu)良的藥理活性。下文主要介紹4種途徑特異性前體的合成研究，這些特異前體不是直接來源于初級代謝產(chǎn)物，而是由子囊霉素生物合成基因簇中相關(guān)基因編碼形成的。

3.1　PKS起始單元4，5-二羥基-1-烯-環(huán)己酸(DHCHC)的合成機制

圖3　子囊霉素的合成前體［2］Fig．3　Precursors of ascomycin［2］

Paiva等［11］通過同位素標(biāo)記實驗指出FK520側(cè)鏈4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基結(jié)構(gòu)來源于莽草酸。2011年，Jennifer等［12］根據(jù) Lowden等提出的 FK520生物合成直接起始單元為4，5-二羥基-1-烯-環(huán)己酸(DHCHC)的觀點［13］，分別以莽草酸和分支酸作為底物，對分支酸水解酶進行體外測活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以莽草酸為底物的實驗中沒有檢測到產(chǎn)物的生成，而在以分支酸為底物的實驗中檢測到了3，4-二羥基-1，5-二烯-環(huán)己酸(DCDC)和丙酮酸的生成，證實了DCDC的生物合成是以分支酸為直接底物的水解反應(yīng)。Jennifer等［12］還指出DHCHC形成的關(guān)鍵步驟是分支酸水解作用形成DCDC，根據(jù)fkb O基因可能編碼分支酸水解酶，利用HPLC-MS和NMR分析測定經(jīng)純化重組的FkbO能夠有效地提高分支酸酶的催化效率，表明了FkbO可以作用于分支酸的水解反應(yīng)。最終闡明了PKS起始單元DHCHC的形成過程，如圖4所示:分支酸在FkbO的作用下，水解為丙酮和DCDC，DCDC再經(jīng)過氧化過程形成DHCHC。

圖4　PKS起始單元DHCHC的形成機制［12］Fig．4　Formation mechanism of DHCHC［12］

3.2　PKS延伸單元甲氧基丙二酰ACP的合成機制

Carroll等［14］通過異源表達實驗驗證了FkbG具有O-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，又通過敲除實驗證明了FkbG是在延伸單元上載前起作用，由此指出了PKS識別的延伸單元是甲氧基丙二酰ACP。Chan等［15］分析總結(jié)前人工作，推導(dǎo)了由 FkbGHIJK催化的PKS延伸單元甲氧基丙二酰ACP的代謝機制:FkbH催化1，3-二磷酸甘油酸脫磷酸化，通過硫酯鍵聯(lián)結(jié)到ACP(由fkb J編碼);甘油酰ACP在FkbK催化作用下形成2-羥基-3-氧代?；鵄CP，F(xiàn)kbK的產(chǎn)物再經(jīng)?；鵄CP脫氫酶FkbI氧化生成羥基丙二酰ACP，羥基丙二酰ACP通過FkbG甲基化作用生成甲氧基丙二酰ACP。

3.3　PKS延伸單元乙基丙二酰CoA的合成機制

FK520與他克莫司(FK506)化學(xué)結(jié)構(gòu)唯一的差別在于FK506 C-21位的特異側(cè)鏈?zhǔn)窍┍鶄?cè)鏈，而子囊霉素在相應(yīng)的位置是乙基官能團。子囊霉素PKS延伸單元AT4(acyl transfer，AT)結(jié)構(gòu)域特異性識別乙基丙二酰CoA，使得子囊霉素C-21位的特異側(cè)鏈?zhǔn)且一?。Wu等［5］通過研究分析推測出了吸水鏈霉菌中乙基丙二酰CoA的合成途徑，如圖5所示:吸水鏈霉菌在營養(yǎng)生長期積累的聚羥基丁酸酯(PHB)在fkb U基因編碼的PHB解聚酶作用下，生成3-羥基丁酰CoA;3-羥基丁酰CoA在fkb E編碼的脫水酶催化下，脫水形成巴豆酰CoA;巴豆酰CoA經(jīng)fkb S基因編碼的巴豆酰CoA還原酶催化下，生成丁酰CoA;丁酰CoA經(jīng)酰基CoA羧化酶作用最終合成乙基丙二酰CoA。

圖5　吸水鏈霉菌中乙基丙二酰CoA合成途徑［5］Fig．5　Biosynthetic pathway of ethylmalonyl-CoA［5］

3.4　NRPS延伸單元L-哌啶甲酸的合成機制

Paiva等［16］通過同位素發(fā)酵飼喂實驗發(fā)現(xiàn)，引入哌啶結(jié)構(gòu)的NRPS延伸單元可能來源于L-賴氨酸的哌啶甲酸。Schwecke等［17］指出，負責(zé)編碼環(huán)化脫氨酶的rap L可能負責(zé)L-賴氨酸直接轉(zhuǎn)變?yōu)長-哌啶甲酸，而FK520基因簇上rap L的同源基因是fkb L。Gatto等［18］報道RapL具有L-賴氨酸環(huán)化脫氨酶的活性，RapL作用底物是L-賴氨酸，輔助因子為煙酰胺。通過測定RapL的體外反應(yīng)動力學(xué)的數(shù)據(jù)，提出RapL(FkbL)作用于L-賴氨酸環(huán)化脫氨酶的酶催化的反應(yīng)機制。其催化過程如圖6所示:NAD+與FkbL蛋白結(jié)合，可輔助催化L-賴氨酸發(fā)生氧化作用，而NAD+轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)NADH;氧化后的亞氨基酸在FkbL的活性位點完成分子內(nèi)環(huán)化和脫氫反應(yīng);最后，NADH為環(huán)化亞胺的環(huán)化作用提供還原氫，L-賴氨酸則可以從蛋白解離，而NAD+可循環(huán)參與下一輪的催化反應(yīng)。

圖6　L-賴氨酸環(huán)化脫氨酶RapL(FkbL)的酶催化反應(yīng)機理［18］Fig．6　Catalytic mechanism of RapL(FkbL)［18］

4　發(fā)酵法生產(chǎn)子囊霉素的研究進展

子囊霉素是由日本藤澤(Fujiasawa)制藥公司于1962年首次從吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus No．KK317的發(fā)酵液中提取得到的。2007年，Parveen等［19］改變種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及比例，優(yōu)化了Streptomyces hygroscopicus的發(fā)酵培養(yǎng)通氣量和溫度，并在發(fā)酵過程中添加一定量的糊精使得子囊霉素產(chǎn)量達到了350～400 mg/L。

目前，國內(nèi)對發(fā)酵法生產(chǎn)子囊霉素的研究主要關(guān)于誘變選育突變菌株和發(fā)酵條件的優(yōu)化。2008年，穆［20］等誘變篩選獲得了誘變菌株M-7-21，子囊霉素產(chǎn)量約為原始產(chǎn)生菌的5倍，并研究了在發(fā)酵過程中添加莽草酸作為前體物質(zhì)，最終產(chǎn)量達到131.7 mg/L。2012 年，Qi等［2，21］通過鈦寶石激光系統(tǒng)對出發(fā)菌株NT2-11進行誘變選育子囊霉素高產(chǎn)突變株，建立了最適宜的誘變條件，并選育出了穩(wěn)定遺傳的子囊霉素高產(chǎn)突變菌株FS35，其產(chǎn)量提高了45%，達到了240 mg/L。2013年，本課題組將吸水鏈霉菌莽草酸耐受篩選及外源添加優(yōu)化應(yīng)用于提高子囊霉素產(chǎn)量的研究中，獲得了高產(chǎn)子囊霉素突變株SA68［22］，在最優(yōu)莽草酸添加條件下，子囊霉素產(chǎn)量提高到了450 mg/L，提高了66.7%。為了深入揭示莽草酸耐受和添加對子囊霉素合成的影響，對子囊霉素發(fā)酵特性、相關(guān)酶活、代謝物和基因轉(zhuǎn)錄水平進行了解析和評估。確定了高產(chǎn)子囊霉素的潛在靶標(biāo):增強DAHPS酶活提高莽草酸代謝通量，消除芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)對DAHPS的反饋抑制作用，過表達fkb O基因增強FkbO酶活以提高子囊霉素合成前體DHCHC的合成通量。這些潛在靶標(biāo)的揭示為我們工程改造高產(chǎn)子囊霉素菌株提供了指導(dǎo)價值。此外，在選育高產(chǎn)菌株的同時，大孔吸附樹脂HP-20添加結(jié)合代謝輪廓分析被用來改進子囊霉素發(fā)酵工藝。在發(fā)酵24 h添加5%(質(zhì)量體積比)吸附樹脂HP-20，發(fā)酵效果最佳，子囊霉素產(chǎn)量從300 mg/L提高到380 mg/L。進一步利用基于GC-MS代謝輪廓分析手段，動態(tài)對比了菌體在2種不同培養(yǎng)條件下(正常發(fā)酵和添加樹脂發(fā)酵)的胞內(nèi)代謝水平及子囊霉素合成水平，解析了菌株在樹脂條件下高產(chǎn)子囊霉素的代謝狀態(tài)，確定了子囊霉素進一步提高的潛在限制因素。進而對發(fā)酵培養(yǎng)基進行理性改進:24 h添加2%(體積比)正十六烷、48 h添加1.0 g/L的纈氨酸和72 h添加0.6 g/L的賴氨酸，子囊霉素產(chǎn)量提高到了460 mg/L，提高了53%［23］。

5　總結(jié)與展望

近年來，雖然對子囊霉素菌株改造和發(fā)酵的生產(chǎn)研究投入了大量的精力，但子囊霉素產(chǎn)量低、生產(chǎn)周期長、中間產(chǎn)物復(fù)雜、生產(chǎn)成本高等傳統(tǒng)問題依舊亟待解決。除了傳統(tǒng)的誘變育種獲得高產(chǎn)菌種和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基以及條件的控制，系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)等學(xué)科的應(yīng)用已經(jīng)成為目前控制微生物代謝，提高微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的有效手段。今后，可以從以下兩方面入手構(gòu)建高產(chǎn)FK520工程菌株:

1)通過構(gòu)建高精度、FK520代謝網(wǎng)絡(luò)模型，采用代謝組學(xué)結(jié)合通量組學(xué)的研究方法，分析子囊霉素整個代謝途徑，確定子囊霉素生物合成的限速步驟和關(guān)鍵靶點，對FK520生物合成相關(guān)靶基因進行基因工程改造，進而獲得子囊霉素的高產(chǎn)菌株。

2)隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，可以建立子囊霉素人工合成途徑系統(tǒng)，從生物元件庫中募集不同來源的高效催化元件構(gòu)建多酶耦合體系，應(yīng)用蛋白納米纖維和病毒顆粒包裝蛋白構(gòu)建新的通用型、納米尺度、串聯(lián)的“蛋白腳手架”，在元件比例、類型等方面進行精確組合設(shè)計，對人工合成途徑中的催化元件進行有序“鉚定”，建立高效的多酶耦合催化系統(tǒng)，使更多的代謝流流向子囊霉素的合成途徑，阻斷或減少代謝流流向副產(chǎn)物合成途徑，提高子囊霉素的產(chǎn)量和藥效，最終獲得高效子囊霉素合成菌株。

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