紅心曲來(lái)源Thermoascus aurantiacus QH-1 的生長(zhǎng)代謝特征

唐藝婧，來(lái)歡歡，趙 微，崔美林，張秀紅,

（1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030000；2.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西太原 030000）

嗜熱子囊菌（Thermoascus）屬于真菌門(mén)，子囊菌亞門(mén)，散囊菌目，耐熱囊菌科（Thermoascaceae），是一類(lèi)嗜熱真菌，即最低生長(zhǎng)溫度為20 或20 ℃以上，最高生長(zhǎng)溫度為50 ℃或50 ℃以上的特殊真菌類(lèi)群[1]。嗜熱子囊菌屬具有橙黃或紅棕的閉囊殼，含有6～8個(gè)子囊孢子，不同菌種的無(wú)性時(shí)代區(qū)較大，可以沒(méi)有，也可以是擬青霉?fàn)罨蛘叨鄶M青霉?fàn)頪2]。自1907 年首次被分離出來(lái)，目前的菌種并不多，只有六個(gè)種（T.aegyptiacus,T.aurantiacus,T.crustaceus,T.isatschenkoi,T.taitungiacus和T.thermophilus）和兩個(gè)變種（T.crustaceusvar.verrucosus和T.aurantiacusvar.levisporus）[3]。嗜熱真菌多存在于堆肥、草堆、植物種子堆、沙漠、溫泉等溫度較高的自然環(huán)境中，能產(chǎn)生多種耐熱的生物大分子水解酶類(lèi)，尤其是纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶等。如廣西土壤分離的黃嗜熱子囊菌T.aurantiacusQS7-2-4 木聚糖酶最佳的合成溫度是50 ℃，木聚糖酶的最適溫度高達(dá)70～80 ℃[4]；T.crustaceusJCM12803 的雙功能木聚糖/纖維素酶對(duì)櫸木木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、羧甲基纖維素鈉和地衣多糖均有降解活性，最適pH 和最適溫度分別為5.0 和65～70 ℃[5]；黃嗜熱子囊菌幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH 值為8.0，70 ℃處理30 min 仍有45%的相對(duì)酶活，具有較好的熱穩(wěn)定性及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[6]。

近年來(lái)，在中國(guó)白酒釀造的大曲和酒醅中也發(fā)現(xiàn)大量嗜熱子囊菌，如在濃香型中溫大曲制曲過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，嗜熱子囊菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，在第10 d 時(shí)比例高達(dá)77.1%，之后一直保持在40%以上[7]；在生產(chǎn)醬香白酒的高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)中，紅曲和白曲中嗜熱子囊菌屬竟占到真菌的84%和65%，黑曲和黃曲中略少，分別為18%和13%[8]；河北醬酒大曲制曲過(guò)程中，發(fā)酵10 d 時(shí)嗜熱子囊菌屬也占到真菌的64.4%[9]；湖北襄陽(yáng)高溫大曲中，嗜熱子囊菌屬在白曲、黑曲和黃曲都是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌，比例高達(dá)34.76%[10]；同時(shí)，在其他的大曲中也發(fā)現(xiàn)大量嗜熱子囊菌存在[11-15]。不僅在大曲中，在濃香白酒酒醅中也發(fā)現(xiàn)大量嗜熱子囊菌。Zhang 等[16]將四川綿竹濃香白酒廠的酒醅置于玻璃瓶中30 ℃發(fā)酵70 d，嗜熱子囊菌屬和曲霉屬在整個(gè)發(fā)酵期平均豐度大于10%而成為核心真菌。郭敏等[17]對(duì)醬香型白酒微生態(tài)多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)，嗜熱子囊菌是醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程真菌微生物中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，它可以產(chǎn)生多種具有高活力及熱穩(wěn)定性的水解酶，有利于釀酒原料被其他微生物利用，起到促進(jìn)微生物繁殖生長(zhǎng)以及產(chǎn)酒生香的作用；黃嗜熱子囊菌能產(chǎn)生α-淀粉酶，與玉米、玉米芯、稻草和大豆相比，在麩皮培養(yǎng)基上α-淀粉酶活性最高，而且其α-淀粉酶在10%的酒精濃度下酶活性還能保留90%以上[18]。嗜熱子囊菌有可能是中國(guó)白酒釀造的功能菌，但對(duì)于純菌株的生長(zhǎng)特性尚不清楚。本課題組發(fā)現(xiàn)嗜熱子囊菌屬是清香大曲紅心曲紅心部分的關(guān)鍵微生物，并且從清香大曲中的紅心曲中分離到的一株可以產(chǎn)紅色色素的黃嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacusQH-1），所以本文從培養(yǎng)基、起始pH、裝液量、接種量、制曲原料、乙醇含量及致死溫度等方面探討其生物學(xué)特性，并將其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，測(cè)量其理化指標(biāo)，為該菌株后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacusQH-1）分離自紅心曲，保藏于本實(shí)驗(yàn)室；小麥、豌豆 山東菏澤；大麥 河南信陽(yáng)；高粱米 四川成都；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；發(fā)酵專(zhuān)用麥芽浸粉、瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司；蔗糖、KH2PO4、CuSO4·5H2O 分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；葡萄糖 分析純，天津市北辰方正試劑廠；KCl 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；NaNO3、FeSO4·7H2O、MgSO4分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；ZnSO4·7H2O、三氯乙酸 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；Yeast Extract Powder 酵母粉 優(yōu)級(jí)純，賽默飛世爾科技公司；VB1生物試劑，廣州碩譜生物科技有限公司；NaOH分析純，洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；馬鈴薯葡萄糖水、PDA 培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇 分析純，天津市北辰方正試劑廠；甘油 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；MEA培養(yǎng)基 北京酷來(lái)搏科技有限公司。

GI80DS 立式壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門(mén)）儀器有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì) 上海雷磁儀器廠；ZHJH-C1112B 智城超凈工作臺(tái)、ZXMP-R1230 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；D-37520 低速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BSA124S 分析天平（感量0.0001 g）瑞士METTLER TOLEDO 公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；V-1800PC 型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 SDA 培養(yǎng)基；察氏培養(yǎng)基；25%甘油硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（G25N）；種子培養(yǎng)基：在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，加入的蛋白胨18 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，VB10.05 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽浸出粉2 g/L，酵母浸出粉18 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，VB10.05 g/L；小麥浸出液：200 g 小麥，加入800 mL 水，蒸煮30 min，3 層紗布過(guò)濾；小麥、大麥浸出液：小麥與大麥共稱(chēng)取200 g，其配比為85:15，加入800 mL 水，蒸煮30 min，3 層紗布過(guò)濾；大麥、豌豆浸出液：大麥與豌豆共稱(chēng)取200 g，其配比為65:35，加入800 mL 水，蒸煮30 min，3 層紗布過(guò)濾；高粱米浸出液：200 g 高粱米，加入800 mL 水，蒸煮30 min，3 層紗布過(guò)濾[19-20]。大麥豌豆培養(yǎng)基：大麥與豌豆粉碎過(guò)篩按照65:35 的比例混勻，粗粉與細(xì)粉的比例為6:4（粗粉為過(guò)60 目篩，細(xì)粉為過(guò)30 目篩），加水量為原料的38%，隨后用玻璃棒攪拌均勻[21]。

1.2.2 黃嗜熱子囊菌的培養(yǎng) 將黃嗜熱子囊菌接種在PDA 培養(yǎng)基上活化5～7 d，鏟出1 cm×1 cm 的菌餅，采用“三點(diǎn)”接種法，分別將菌餅接種于在PDA、MEA、SDA、察氏培養(yǎng)基和G25N 培養(yǎng)基中，各菌餅相隔約40 mm，每種培養(yǎng)基設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，于45 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每天觀察黃嗜熱子囊菌菌株在不同培養(yǎng)基上的菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌落形態(tài)、菌絲和菌落顏色變化[22]。

1.2.3 種子液的制備 將儲(chǔ)存于斜面的黃嗜熱子囊菌接種在PDA 培養(yǎng)基上活化5～7 d，使用接種鏟取出1 cm×1 cm 的菌餅7～8 塊，放置于種子培養(yǎng)基中，在溫度為45 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min 的搖床中培養(yǎng)3 d，將一代種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1 d，即得種子液[23-24]。

1.2.4 培養(yǎng)條件對(duì)黃嗜熱子囊菌生長(zhǎng)的影響

1.2.4.1 溫度“三基點(diǎn)”的確定 將直徑為1 cm 的菌餅置于PDA 培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)在溫度為30、35、45、55、60 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d，觀察菌絲生長(zhǎng)，確定最低生長(zhǎng)溫度及致死溫度的范圍，再按1 ℃溫度梯度進(jìn)行上述處理確定最終的菌株最低生長(zhǎng)溫度及致死溫度[25]。

1.2.4.2 pH 對(duì)黃嗜熱子囊菌生長(zhǎng)的影響 參照郭淑清[26]的方法，使用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 調(diào)成 3、4、5、6、7。按照5%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一定時(shí)間后，把發(fā)酵液取出，按照菌絲干重的測(cè)定方法，對(duì)生長(zhǎng)在不同pH 發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌絲干重進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.3 接種量對(duì)黃嗜熱子囊菌生長(zhǎng)的影響 分別按照3%、5%、7%、9%、11%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一定時(shí)間后，把發(fā)酵液取出，按照菌絲干重的測(cè)定方法，對(duì)菌絲干重進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.4 裝液量對(duì)黃嗜熱子囊菌生長(zhǎng)的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基按照80、100、120、140、160、180 mL 裝入250 mL 的錐形瓶中。以接種量為5%的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)一定時(shí)間后，把發(fā)酵液取出，按照菌絲干重的測(cè)定方法，對(duì)生長(zhǎng)在不同裝液量發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌絲干重進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.5 制曲釀酒原料對(duì)黃嗜熱子囊菌生長(zhǎng)的影響把種子液按5%的量接種于小麥、小麥和大麥、大麥和豌豆、高粱米浸出液培養(yǎng)基。培養(yǎng)一定時(shí)間后，把發(fā)酵液取出，按照菌絲干重的測(cè)定方法，對(duì)菌絲干重進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.6 黃嗜熱子囊菌乙醇耐受性分析 將種子液按5%的接種量接種于含有0、3%、6%、9%、12%、15%乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，把發(fā)酵液取出，按照菌絲干重的測(cè)定方法，對(duì)菌絲干重進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.7 黃嗜熱子囊菌的生長(zhǎng)曲線及代謝分析 把種子液按5%的量接種于大麥和豌豆固體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)溫度45 ℃），于培養(yǎng)天數(shù)為2、4、6、8、10 d 時(shí)取出固態(tài)培養(yǎng)物，對(duì)固態(tài)培養(yǎng)物的生物量、pH、酸度、糖化力及液化力進(jìn)行測(cè)定。pH、酸度、糖化力及液化力的測(cè)定方法參考QB/T 4257-2011。黃嗜熱子囊菌固態(tài)培養(yǎng)物生物量的測(cè)定：稱(chēng)取0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g 的液體培養(yǎng)所得純菌體，分別加入25 mL 5%的三氯乙酸溶液，80 ℃水浴25 min，隨即冰浴冷卻，于8000 r/min，4 ℃離心15 min，以5%三氯乙酸作空白對(duì)照，于260 nm 處測(cè)OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后取0.25 g 固態(tài)培養(yǎng)物，適當(dāng)研磨，按照純菌體中核酸的提取方法進(jìn)行提取，未經(jīng)發(fā)酵的固態(tài)基質(zhì)采用同樣的方法處理作為空白對(duì)照，在260 nm處測(cè)定提取液的OD 值，由所測(cè)OD 值對(duì)照純菌體標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系換算成菌體量[27]。以純菌體質(zhì)量為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)所得黃嗜熱子囊生物量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=26.17x+0.1011，R2=0.9988。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)測(cè)得的所有數(shù)據(jù)均利用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行處理，運(yùn)用Origin 2021 軟件完成相關(guān)圖的繪制，其顯著性用SPSS 20.0 軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響

將活化的黃嗜熱子囊菌QH-1 接種在PDA、MEA、SDA、察氏培養(yǎng)基和G25N 培養(yǎng)基上，5 d 后菌落形態(tài)如圖1 所示。從圖1 中可以看出，PDA、MEA 和SDA 三種培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，在PDA、MEA 和SDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較快，3 d 基本長(zhǎng)滿整個(gè)平板，而且菌絲致密呈輻射狀生長(zhǎng)，在PDA、MEA 上有明顯褶皺形成，并且還有色素的產(chǎn)生，在PDA 和SDA 上色素呈橙色，在MEA 上則為暗紅色；察氏培養(yǎng)基為合成培養(yǎng)基菌株，菌絲非常稀疏，生長(zhǎng)較慢，也沒(méi)有色素合成；G25N 培養(yǎng)基在察氏培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了酵母浸出粉和大量甘油，在此培養(yǎng)基上黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)速度最慢，在45 ℃培養(yǎng)5 d 后，菌落直徑僅1.2 cm，幾乎沒(méi)有色素合成，說(shuō)明甘油不是該菌株適宜的碳源。

圖1 培養(yǎng)基對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of culture medium on Thermoascus aurantiacus QH-1growth

2.2 黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)的測(cè)定

溫度是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素。將活化好的黃嗜熱子囊菌QH-1 接種到PDA 培養(yǎng)基上，在不同溫度下生長(zhǎng)5 d，其菌落直徑如圖2。從圖2 中可以看出，黃嗜熱子囊菌QH-1 在不同溫度下菌落直徑相差較大，45 ℃生長(zhǎng)最快，菌落直徑高達(dá)9 cm，而且在3 d 時(shí)就鋪滿整個(gè)平板；其次是55 ℃，直徑為3.7 cm，35 ℃生長(zhǎng)比較弱，僅1.4 cm，在30 和60 ℃幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)?？梢?jiàn)最適生長(zhǎng)溫度為45 ℃。為進(jìn)一步確定其最低和最高生長(zhǎng)溫度，從26～30 ℃和56～60 ℃范圍內(nèi)，每相差1 ℃考察其生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 可以看出，黃嗜熱子囊菌QH-1 在26 和60 ℃不能生長(zhǎng)，因此26 和60 ℃就是該菌株的最低和最高生長(zhǎng)溫度，滿足20 ℃以下不能生長(zhǎng)，最高生長(zhǎng)溫度大于50 ℃，是典型的嗜熱真菌。

表1 黃嗜熱子囊菌QH-1 的最低及最高生長(zhǎng)溫度Table 1 The maximum and minimum growth temperature of Thermoascus aurantiacus QH-1

圖2 溫度對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響Fig.2 Growth of Thermoascus aurantiacus QH-1 on different temperature

2.3 pH 對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響

pH 也是影響微生物的生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)物合成的關(guān)鍵因素[28]。pH 對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖3 所示。從圖3 中可以看出，隨著pH 的不斷升高，菌株的生物量不斷增高。在pH4 時(shí)，黃嗜熱子囊菌QH-1 的生物量最高，其干重可達(dá)2.09 g，菌株在pH4～6 范圍內(nèi)無(wú)顯著性區(qū)別；而在pH7 時(shí)，黃嗜熱子囊菌QH-1 的干重顯著性降低，只有1.09 g。整體看來(lái)，黃嗜熱子囊菌QH-1 適宜在pH<7 的弱酸性環(huán)境生長(zhǎng)。

圖3 pH 對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of pH on the growth of Thermoascus aurantiacus QH-1

2.4 接種量對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響

接種量是影響菌株生長(zhǎng)的重要因素。一般接種量過(guò)高，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，菌體密度過(guò)高，使得菌體營(yíng)養(yǎng)供給不足；接種量過(guò)低，菌種密度低，繁殖速度較慢[29]。黃嗜熱子囊菌QH-1 在不同接種量培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖4 所示。從圖中可以看出，黃嗜熱子囊菌的接種量為3%時(shí)，菌株的生物量最高，為2.59 g；而隨著接種量的升高，生物量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，推測(cè)是由于接種量過(guò)高，菌種繁殖速度較快從而導(dǎo)致培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，使后期生長(zhǎng)受到影響導(dǎo)致最終生物量降低。

圖4 接種量對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth of Thermoascus aurantiacus QH-1

2.5 裝液量對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響

裝液量會(huì)影響培養(yǎng)基中的溶解氧而影響微生物的生長(zhǎng)。一般裝液量越少，傳氧系數(shù)越大。由于黃嗜熱子囊菌QH-1 培養(yǎng)溫度稍高，在液體培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)酵液的蒸發(fā)不容忽視[30]。所以在液態(tài)培養(yǎng)時(shí)，需要對(duì)搖瓶裝液量進(jìn)行研究，找出適合的裝液量。黃嗜熱子囊菌QH-1 在不同裝液量培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況如圖5所示。從圖中可以看出，隨著裝液量的不斷增加，微生物的生物量也在增加。在裝液量達(dá)到160 mL 時(shí)，黃嗜熱子囊菌QH-1 的生物量最高，為3.31 g；而在裝液量為180 mL 時(shí)，生物量出現(xiàn)了下降，為2.99 g，推測(cè)由于裝液量過(guò)高，使得錐形瓶?jī)?nèi)氧氣含量降低，導(dǎo)致菌體死亡。因此160 mL 為黃嗜熱子囊菌QH-1 液態(tài)培養(yǎng)的最佳裝液量。

圖5 裝液量對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of liquid volume on the growth of Thermoascus aurantiacus QH-1

2.6 制曲原料對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響

黃嗜熱子囊菌在多種大曲中發(fā)現(xiàn)，有可能是釀酒功能菌[31-34]。不同的釀酒原料由于營(yíng)養(yǎng)成分及比例不同，會(huì)影響黃嗜熱子囊菌QH-1 的生長(zhǎng)。將黃嗜熱子囊菌QH-1 接種在不同釀酒原料制成的液態(tài)培養(yǎng)基，其生長(zhǎng)情況如圖6 所示。從圖中可以看出，黃嗜熱子囊菌QH-1 在高粱米液態(tài)培養(yǎng)基中的生物量最高，為0.57 g；而在小麥和大麥制成的混合培養(yǎng)基中的生物量最低，僅0.24 g/100 mL。此外，從圖6中可以看出，黃嗜熱子囊菌QH-1 在3 d 內(nèi)的生長(zhǎng)狀況沒(méi)有在以發(fā)酵培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)的效果好，其原因是微生物在短期生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，不能直接利用制曲原料中復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)成分，例如多糖、纖維素等，而相對(duì)于制曲原料來(lái)說(shuō)，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分比較簡(jiǎn)單，黃嗜熱子囊菌QH-1 可以直接利用。因此，黃嗜熱子囊菌QH-1 在合成培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度高于在天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而在天然培養(yǎng)基中，高粱米是最佳培養(yǎng)原料。

圖6 不同制曲原料對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生物量的影響Fig.6 Effects of different materials on the biomass of Thermoascus aurantiacus QH-1

2.7 黃嗜熱子囊菌QH-1 乙醇耐受性分析

在白酒的釀造過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，乙醇是最主要的代謝產(chǎn)物，會(huì)影響很多酒醅微生物的生長(zhǎng)代謝，乙醇耐受性是釀酒微生物必備的重要特性[35]。黃嗜熱子囊菌QH-1 在不同乙醇濃度培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖7 所示。從圖中可以看出，黃嗜熱子囊菌QH-1 在0～6%乙醇含量的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3 d 后的生物量沒(méi)有顯著性差異，為1.16～1.26 g，也就是說(shuō)6%的乙醇對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 的生長(zhǎng)沒(méi)有任何影響；當(dāng)乙醇含量增長(zhǎng)為9%時(shí)生物量出現(xiàn)了顯著下降為0.77 g，并且隨著乙醇含量的不斷增加，生物量明顯下降。因此低濃度乙醇含量不會(huì)影響黃嗜熱子囊菌QH-1 的生長(zhǎng)，但隨著乙醇含量的不斷增加，其生長(zhǎng)會(huì)受到影響。

圖7 乙醇濃度對(duì)黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of different ethanol content on the biomass of Thermoascus aurantiacus QH-1

2.8 黃嗜熱子囊菌QH-1 的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力

為了進(jìn)一步考察黃嗜熱子囊菌QH-1 在清香大曲制曲過(guò)程中的生長(zhǎng)代謝，為該菌的開(kāi)發(fā)利用提供信息，將黃嗜熱子囊菌QH-1 以5%的接種量接種于大麥和豌豆組成的固態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)不同時(shí)間后測(cè)定其生長(zhǎng)量以及培養(yǎng)物的pH 和酸度，結(jié)果如圖8 所示。從圖8 中可以看出，黃嗜熱子囊菌QH-1 在清香大曲原料中可以生長(zhǎng)，前期生長(zhǎng)較為緩慢，6～8 d 生長(zhǎng)較快，之后趨于平穩(wěn)，第10 d 達(dá)到0.45 g/g。黃嗜熱子囊菌QH-1 在大麥豌豆培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，能產(chǎn)生少量的酸，在第10 d 固態(tài)培養(yǎng)物中酸度達(dá)到2.1 mmol/10 g，pH 則從7.44 降到6.86。釀酒過(guò)程中，大曲糖化酶將高粱淀粉降解為還原糖后，經(jīng)酵母菌轉(zhuǎn)化為酒精，如果其他微生物將還原糖代謝為酸等其他代謝產(chǎn)物將會(huì)降低產(chǎn)酒率。酒醅中往往有大量乳酸菌，把還原糖轉(zhuǎn)化為乳酸，形成白酒主要風(fēng)味物質(zhì)，但是如果乳酸過(guò)多，除了降低酒精產(chǎn)量外，乳酸與乙醇酯化為乳酸乙酯，改變酒醅中乙酸乙酯與乳酸乙酯的比例，改變清香白酒的口感，進(jìn)而影響新產(chǎn)酒的質(zhì)量[36]。另外，絲狀真菌也在酒醅中出現(xiàn)，如黑曲霉、紅曲霉和米根霉等均可代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，也會(huì)影響產(chǎn)酒率[37-43]。黃嗜熱子嚢菌QH-1 在45 ℃產(chǎn)酸較少，pH 僅下降0.58，在正常釀酒的條件下，產(chǎn)酸可能會(huì)更少些，不會(huì)影響產(chǎn)酒率。

圖8 黃嗜熱子囊菌QH-1 的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸變化Fig.8 Growth curve and changes in acid production of Thermoascus aurantiacus QH-1

2.9 黃嗜熱子囊菌QH-1 糖化力和液化力分析

大麥和豌豆主要成分是淀粉，黃嗜熱子囊菌QH-1 純菌株能在大麥豌豆固態(tài)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說(shuō)明其能產(chǎn)生一定的淀粉酶。因此，考察了其糖化力和液化力，結(jié)果如圖9 所示。從圖9 可知，在培養(yǎng)前4 d幾乎沒(méi)有糖化酶，第6 d 開(kāi)始檢測(cè)到糖化酶，之后糖化酶活性逐漸增強(qiáng)，第10 d 時(shí)達(dá)到349 U，糖化力的變化趨勢(shì)與其生長(zhǎng)曲線較為相似，說(shuō)明黃嗜熱子囊菌QH-1 產(chǎn)生糖化力降解淀粉產(chǎn)生葡萄糖，提供碳源在黃嗜熱子囊菌QH-1 生長(zhǎng)中起到重要作用。液化力直到第10 d 才檢測(cè)到，為0.73 U。本課題組在跟蹤大曲制作過(guò)程中液化力變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)液化力也是在制曲后期出現(xiàn)，推測(cè)液化酶可能需要特殊的物質(zhì)誘導(dǎo)才能合成。從圖8 的生長(zhǎng)曲線可知，第10 d 時(shí)黃嗜熱子囊菌QH-1 處于穩(wěn)定期，會(huì)有大量次生代謝物出現(xiàn)，因而誘導(dǎo)液化酶合成并表現(xiàn)出活性。

圖9 黃嗜熱子囊菌QH-1 固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的糖化力與液化力Fig.9 Saccharification and liquefaction power of solid-state fermentation of Thermoascus aurantiacus QH-1

3 結(jié)論

本研究對(duì)紅心曲來(lái)源黃嗜熱子囊菌QH-1 的生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。黃嗜熱子囊菌QH-1 在營(yíng)養(yǎng)豐富的PDA、SDA、MEA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率較快，菌絲呈放射性生長(zhǎng)，呈現(xiàn)深淺不等色素；在察氏培養(yǎng)基及G25N 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率較慢，且菌絲稀疏透明。黃嗜熱子囊菌QH-1 的最適生長(zhǎng)條件為：45 ℃，pH4.0，接種量為3%，裝液量為160 mL，6%的乙醇，以高粱米浸出液為培養(yǎng)基。在清香大曲原料大麥豌豆中，前期糖化力較低，生長(zhǎng)較慢，6～8 d 時(shí)糖化力最高，生長(zhǎng)也最快，第10 d 檢出有液化力，在大麥豌豆中的生長(zhǎng)曲線與糖化酶合成曲線較為相似，生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生少量的酸。本研究結(jié)果豐富了大曲的功能微生物，為黃嗜熱子囊菌QH-1 的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供必要信息。但是，紅心曲的重要特征是紅心，黃嗜熱子囊菌QH-1 產(chǎn)生紅色色素的條件還不確定，在制曲釀酒中真正起作用的是色素，還是與色素相平行的其他代謝產(chǎn)物尚不清楚，都需要進(jìn)一步的考察研究。