冬蟲(chóng)夏草菌室內(nèi)侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的代謝分析

韓曉然

[摘 要] 冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)傳統(tǒng)中藥中的一種瀕危物種。關(guān)于冬蟲(chóng)夏草及其無(wú)性型中國(guó)被毛孢的代謝已有很多研究報(bào)道，然而對(duì)于蝙蝠蛾幼蟲(chóng)人工接種中國(guó)被毛孢后的代謝變化卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析可準(zhǔn)確判定人工培養(yǎng)物與天然冬蟲(chóng)夏草的成分差異，從而找出與天然冬蟲(chóng)夏草成分一致的培養(yǎng)物或僵蟲(chóng)，同時(shí)避免有害雜菌感染的樣品用于替代天然冬蟲(chóng)夏草，從而擴(kuò)大蟲(chóng)草藥材的來(lái)源或找到更多、更安全的替代品，創(chuàng)造較大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)有利于保護(hù)野生蟲(chóng)草資源和生態(tài)環(huán)境。

[關(guān)鍵詞] 冬蟲(chóng)夏草;中國(guó)被毛孢;子囊孢子;代謝組學(xué);質(zhì)譜全解析

[中圖分類號(hào)] S567.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)]1674-7909（2020）06--2

1 材料和方法

1.1 材料

3齡蟲(chóng)草蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，采自四川省德陽(yáng)縣蟲(chóng)草基地，室內(nèi)短期人工飼養(yǎng)。

采自青海玉樹(shù)的天然冬蟲(chóng)夏草經(jīng)人工誘導(dǎo)得到具有侵染能力的冬蟲(chóng)夏草子囊孢子。

1.2 方法

1.2.1 接種培養(yǎng)

本研究以子囊孢子懸液為接種體，每個(gè)處理20只蝙蝠蛾幼蟲(chóng)?？紤]到蝙蝠蛾幼蟲(chóng)幾天就蛻皮一次，而蛻皮可能對(duì)侵染不利，故本試驗(yàn)選擇在進(jìn)行浸蘸接種之后進(jìn)一步采取穿刺接種法并同時(shí)將菌液混入幼蟲(chóng)食物中，從而增加侵染成功率。

1.2.2 接種后處理

接種后將幼蟲(chóng)放入事先編號(hào)的已滅菌的培養(yǎng)皿中，僅飼喂少量珠芽蓼，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于16 ℃、避光條件下培養(yǎng)。2 d后繼續(xù)給予珠芽蓼并注意補(bǔ)充無(wú)菌水以保濕培養(yǎng)，5 d后轉(zhuǎn)入土壤中繼續(xù)飼養(yǎng)。每隔4 d檢查統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)死亡情況并加入少量珠芽蓼。珠芽蓼均要求進(jìn)行紫外線照射滅菌消毒。

將侵染所得的死亡僵蟲(chóng)在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察后，置于凍干機(jī)中冷凍干燥后充入氬氣保護(hù)，并放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 代謝組分析

1.2.3.1 樣品的制備。將侵染所得的僵蟲(chóng)、野外采集的野生僵蟲(chóng)、天然冬蟲(chóng)夏草以及人工培養(yǎng)的中國(guó)被毛孢菌絲體同時(shí)進(jìn)行冷凍干燥，之后分別將其置于研缽中磨碎備用;在進(jìn)行代謝組分析之前準(zhǔn)確稱取磨碎后的樣品各15 mg，加入1 mL甲醇提取液和Fmoc-glycine

（1 mg/mL）30 μL作為內(nèi)標(biāo)，渦旋30 s，25 ℃超聲提取

1 h后于4 ℃冰箱中靜置12 h。將提取物在1萬(wàn)r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液作為L(zhǎng)C-TOF/MS待測(cè)樣品。每組樣品各做6組生物學(xué)重復(fù)，并以甲醇溶液作為空白組進(jìn)行對(duì)照。

1.2.3.2 LC-TOF/MS條件。一是HPLC條件。色譜柱Agilent poroshell 120 EC-C18，2.7 μm，30 mm×100 mm，

進(jìn)樣體積3 μl，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min。就流動(dòng)相而言，A相是含0.1%甲酸的水溶液，B相是含0.1%甲酸的乙腈溶液。

二是質(zhì)譜條件。氮?dú)庾鳛楦稍餁怏w，氮?dú)鉁囟葹?50 ℃，流速為12 L/min，霧化氣壓35 psi;毛細(xì)管電壓，陽(yáng)離子4 000 V，陰離子3 500 V;碎裂電壓，陽(yáng)離子215 V，

陰離子170 V，錐孔電壓60 V;質(zhì)量采集范圍，陽(yáng)離子50～1 000 Da，陰離子50～1 100 Da。

1.2.3.3 代謝組數(shù)據(jù)分析。LC-MS采集的原始數(shù)據(jù)用MassHunter Software（Agilent Technologies，USA）的MFE運(yùn)算進(jìn)行自動(dòng)峰檢測(cè)和色譜去卷積，去除信噪比<

5的峰，提取出陰離子和陽(yáng)離子的絕對(duì)峰高≥5 000的峰，并將每個(gè)樣品的三維數(shù)據(jù)（出峰時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量和強(qiáng)度）導(dǎo)出保存。之后將導(dǎo)出的表格文件上傳至MetaboAnalyst[1]進(jìn)行峰對(duì)齊和濾噪處理，處理?xiàng)l件為質(zhì)量偏差0.01 Da、時(shí)間偏差0.5 min，以陽(yáng)離子（m/z）179.085 81、陰離子（m/z）364.079 66 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto Scaling處理。

1.2.3.4 代謝物識(shí)別。①通過(guò)數(shù)據(jù)處理分析得到的化合物，根據(jù)其質(zhì)譜特征、精確質(zhì)荷比和出峰時(shí)間等，利用MassHunter Qualitative Analysis Software初步確認(rèn)其分子式;②在本實(shí)驗(yàn)室積累的蟲(chóng)生真菌天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB、METLIN上進(jìn)行搜索匹配，以確定化合物的名稱;③根據(jù)代謝物的洗脫順序（極性）和結(jié)構(gòu)性質(zhì)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;④將代謝物的UV譜圖與已知物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照，以確定需要查找的差異化合物;⑤對(duì)于一些存在爭(zhēng)議的代謝物質(zhì)，盡可能使用標(biāo)準(zhǔn)品或者查閱相關(guān)昆蟲(chóng)病原真菌的代謝物報(bào)道進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工侵染所得僵蟲(chóng)與天然冬蟲(chóng)夏草HPLC-TOF-MS全成分分析

2.1.1 HPLC-TOF-MS圖譜比較。用HPLC-TOF-MS分別對(duì)通過(guò)子囊孢子懸液侵染所得僵蟲(chóng)與天然冬蟲(chóng)夏草的甲醇超聲提取液中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析比較。圖1是抽取的子囊孢子懸液侵染所得僵蟲(chóng)的液質(zhì)聯(lián)用圖。從圖1可以看到，有些僵蟲(chóng)HPLC-TOF-MS圖譜與野生冬蟲(chóng)夏草幾乎完全一致，有些有明顯差異。

2.1.2 人工侵染所得僵蟲(chóng)與天然冬蟲(chóng)夏草的化學(xué)成分鑒定。通過(guò)HPLC-TOF-MS檢測(cè)得到僵蟲(chóng)與天然冬蟲(chóng)夏草中各化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，并結(jié)合提取離子流圖及與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比以及空白對(duì)照去除雜質(zhì)，最終進(jìn)行了化學(xué)成分的確認(rèn)，根據(jù)質(zhì)譜裂解特征鑒定的主要差異成分如下。

2.1.2.1 酵母氨酸。酵母氨酸t(yī)R為1.682 min的峰在ESI-模式下得到m/z為275.125 18的離子峰。綠僵菌中存在酵母氨酸，其分子質(zhì)量為276.132 14。中國(guó)被毛孢中沒(méi)有酵母氨酸的報(bào)道，而該僵蟲(chóng)（1-3）體內(nèi)是否存在綠僵菌感染還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.1.2.2 粉擬青霉素。粉擬青霉素tR為31.919 min的峰在ESI-模式下得到m/z為372.218 66的離子峰。粉棒束孢中存在粉擬青霉素，其分子質(zhì)量為373.225 31。中國(guó)被毛孢中沒(méi)有粉擬青霉素的報(bào)道，而該僵蟲(chóng)（1-4）體內(nèi)是否存在粉棒束孢侵染還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

在由子囊孢子懸液侵染所得的這組僵蟲(chóng)里，僵蟲(chóng)1-1和1-2與天然冬蟲(chóng)夏草相比差異不大，每個(gè)時(shí)間段都基本可以找到與天然冬蟲(chóng)夏草相對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物。然而，僵蟲(chóng)1-3和1-4與天然冬蟲(chóng)夏草相比差異較為明顯，可以看出部分代謝物只在僵蟲(chóng)中出現(xiàn)，如酵母氨酸、Cytochalasin C、粉擬青霉素、（R）-3-Hydroxybutanoyloxy-butanoate。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)屬于某些與蟲(chóng)草相關(guān)的蟲(chóng)生真菌會(huì)產(chǎn)生的典型次級(jí)代謝產(chǎn)物，如粉棒束孢、綠僵菌等[2]。而1-3和1-4僵蟲(chóng)是否包含粉棒束孢、綠僵菌這兩種真菌的混合侵染還需要進(jìn)行進(jìn)一步分析?？傊?，這些僵蟲(chóng)不能作為天然冬蟲(chóng)夏草的替代品。

3 結(jié)論

通過(guò)HPLC-TOF-MS全成分分析，可更直觀和準(zhǔn)確地比較差異，因此全圖譜比較分析可作為研究冬蟲(chóng)夏草人工替代品的質(zhì)量控制、方法。從分析結(jié)果來(lái)看，本研究中雖然發(fā)現(xiàn)子囊孢子懸液侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的成功率較高，但仍有明顯雜菌污染，在大規(guī)模進(jìn)行人工培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草及其替代品培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)于如何避免雜菌污染來(lái)確保蟲(chóng)草及其產(chǎn)品的真實(shí)性和高質(zhì)量，仍需要進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Jianguo X，Nick P，Nelson Y，et al. MetaboAnalyst： a web server for metabolomics data analysis and interpretation[J].Nucleic Acids Research，2009（37）：652-660.

[2]胡豐林，李增智.蟲(chóng)草及相關(guān)真菌的次生代謝產(chǎn)物及其活性[J].菌物學(xué)報(bào)，2007（4）：607-632.