中國皰衣屬地衣的初步研究

徐亞男, 楊秋霞, 賈澤峰

(1. 聊城大學生命科學學院，山東 聊城 252059；2. 中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室，北京 100101)

皰衣屬[Phlyctis(Wallr.) Flot.]為地衣型真菌，隸屬于真菌界(Fungi)子囊菌門(Ascomycota)茶漬綱(Lecanoromycetes)厚頂盤目(Ostropales)皰衣科(Phlyctidaceae)。該屬在世界上分布較為廣泛，主要分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)，目前全世界已報道該屬有25種[1]。1850 年，F(xiàn)lotow 以Phlyctis agelaea(Ach.) Flot.為模式種界定了皰衣屬[2]?！吨袊匾戮C覽》收錄中國該屬4 種[3]，之后又報道了1 種[2]，主要分布在云南[4]、香港[5-6]、臺灣[7]、湖北[8]和甘肅[2,9]等地區(qū)。

皰衣屬地衣的特征是地衣體殼狀，樹皮生或石生，表面光滑至具有裂縫，常具初生地衣體；子囊盤通常深陷于地衣體中，近埋生或貼生，常帶有白色粉霜；側(cè)絲單一，頂端相互交織，少有分叉；子囊長橢圓狀至棍棒狀，內(nèi)含1~8 個孢子；子囊孢子無色透明，橫隔多胞或磚壁型。光合共生藻為綠藻[10-11]。

本研究基于形態(tài)學、解剖學、化學、分子生物學和生物地理學等方法，對中國皰衣屬地衣進行初步研究，報道中國一新記錄種：類喜馬拉雅皰衣(Phlyctis subhimalayensisS. Joshi & Upreti)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

研究標本采集地為云南，現(xiàn)保藏于中國科學院微生物研究所菌物標本館HMAS-L、山東師范大學植物標本室(SDNU)、Korean Lichen Research Institute (KoLRI)和荷蘭CBS 標本室(ABL)。

1.2 表型研究

在體視顯微鏡(Motic SMZ-168 和LEICA M125)下觀察外部形態(tài)并拍照。在光學顯微鏡(Zeiss Axioscope 2)下對子囊器的內(nèi)部結構進行觀察并拍照?；瘜W特征：利用顏色反應，使用K 試劑(10%氫氧化鉀水溶液)、C 試劑(次氯酸鈉水溶液)和P 試劑(將對苯二胺溶于無水乙醇，配成5%乙醇溶液)進行測試;使用標準的薄層色譜法(TLC)檢測地衣中所含次生代謝物，溶劑系統(tǒng)為C 系統(tǒng)[12-14]。

1.3 基因型研究

DNA的提取擴增和測序采用CTAB 法從皰衣屬標本的子囊組織中提取總DNA[15]，采用PCR擴增核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)，引物為ITS5/ITS4[16]。反應體系總體積為25μL，包括正反向引物各1μL，模板DNA 2μL，ddH2O 8μL 和2×TaqPCR MasterMix?13μL。擴增程序[17]為：95 ℃預變性5 min；然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共34 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并由天一輝遠(北京)生物有限公司進行測序。因研究標本較陳舊，因此，對同一份標本提取DNA 2 次，分別進行PCR擴增及測序，并作為2 條單獨的ITS 序列應用于該屬的系統(tǒng)發(fā)育樹構建(表1)。

表1 地衣標本信息和ITS 序列的GenBank 登錄號Table 1 Lichen specimen information and GenBank accession No.

系統(tǒng)發(fā)育樹構建通過查閱文獻，在NCBI網(wǎng)站下載20 條序列，與本研究的2 條皰衣屬序列,共22 條序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以皰衣科親緣關系較近的凹盤衣科(Gyalectaceae)的Gyalecta屬為外群[18]。使用BioEdit V 7.0.5 中的ClustalW Multiple Alignment 利用最大似然法(Maximum-likelihood,ML)進行比對[19-20]，使用在線網(wǎng)站Cipres Science Gateway (http://www.phylo.org)中的RAxML HPC V.8.2.6 構建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]，運算方法選擇GTR+I+G模型，每個節(jié)點設置1 000 次重復以評價自展支持值。獲得的系統(tǒng)樹文件在FigTree V. 1.4.2 中查看和編輯，自展支持值(bootstrap)≥75%的分支可信(圖1)。

圖1 基于ITS 序列構建的皰衣屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Phlyctis based on ITS sequences

2 結果和分析

2.1 類喜馬拉雅皰衣 (新擬) 圖2

圖2 類喜馬拉雅皰衣(HMAS-L 105300)。A: 地衣體和子囊器；B: 子囊及子囊孢子; C: 子囊孢子。標尺: A=0.5 mm; B=20 μm; C=10 μmFig. 2 Phlyctis subhimalayensis (HMAS-L 105300). A: Thallus with ascomata; B: Ascuswith ascospores; C: Ascospores. Bars: A=0.5 mm; B=20 μm; C=10 μm

Phlyctis subhimalayensisS. Joshi & Upreti,Lichenologist 44(3): 365 (2012)

地衣體殼狀，上表面白色或灰白色，平滑且連續(xù)，無粉芽及裂芽，無前地衣體；共生藻為綠藻。子囊器為子囊盤，埋生于地衣體內(nèi)，子囊盤數(shù)量較多，直徑0.2~0.5 mm，呈分散狀或2~3 個聚集在一起，近似圓形或拉長到角狀，盤面呈黑色，圓形至不規(guī)則，平至凹狀，具有白色粉霜，邊緣灰白色,且呈葉片狀。囊層基呈淺褐色至淺黃色，子實層無色，I-；側(cè)絲較為簡單，頂端相互交織，且不腫脹, 無分叉；子囊棍棒狀，8 個孢子，60~73μm×12~16μm，I-；子囊孢子無色透明，梭形，具5~7橫隔, 37~45μm×4~6μm，I-。

化學反應：地衣體K-，C-，KC-，P-；未檢測到地衣次生代謝產(chǎn)物。

基物：樹皮。

研究標本：云南，楚雄市，附近山上，海拔2 200 m；2002-10-26，任強301 (HMAS-L105300)。

世界分布：印度的喜馬拉雅山北部和東部[22]。

討論：該種主要特征為地衣體表面無粉芽，子囊盤表面帶有白色粉霜，子囊8 個孢子，孢子橫隔型，具有5~7 個橫隔，囊層基呈淺褐色至淺黃色, 無地衣次生代謝產(chǎn)物。在圖1 中，P. subhimalayensis的2 條自測序列完全一致，能夠完好代表標本HMAS-L 105300。分子數(shù)據(jù)分析表明，該種與Phlyctis屬其他物種很好的聚為一單系分支，支持值高達99%;且與Phlyctis屬其他物種明顯分開，作為獨立分支,因此鑒定為P. subhimalayensis。

該種與P. himalayensis(Nyl.) D. D. Awasthi 和P. karnatakanaS. Joshi & Upreti 較為相似，子囊孢子具有7 個橫隔，但在子囊孢子的大小和地衣次生代謝產(chǎn)物方面明顯區(qū)分于后兩者，P. karnatakana的子囊孢子25~35μm×4~7μm，P. himalayensis的子囊孢子60~75μm×18~24μm，二者地衣體均遇K+紅色，P. himalayensis具有未知的地衣化合物，P.karnatakana具有降斑點酸(norstictic acid)[23-24]。此外，該種還與P. megalospora(P. James) D. J. Galloway & G. Guzmán 具有相似之處，這2 種的子囊孢子均呈橫隔型，然而P. megalospora的孢子大小為285~390μm×79~95μm，且地衣體含斑點酸(stictic acid)和茶痂衣酸(psoromic acid)[10]。

2.2 中國已報道皰衣屬物種

亮皰衣Phlyctis argena(Ach.) Flot., Bot. Ztg. 8:572 (1850)

地衣體殼狀，表面被粉芽堆覆蓋，帶有白色粉霜，聚集在地衣體表面。子囊盤不常見，子囊單孢，子囊孢子無色透明，磚壁型，100~150μm×25~50μm。含有降斑點酸。

研究標本：臺灣，南投縣河谷，950 m，Aptroot 52055、53436 (ABL)。

基物：樹皮。分布：臺灣[6]。

討論：該種主要特征是地衣體具有豐富的粉芽；子囊盤不常見；子囊單孢，子囊孢子磚壁型,大小100~150μm×25~50μm。本種與P. agelaea、P. speirea、P. karnatakana和P. subargena相似，如子囊盤表面都具有白色粉霜，含有降斑點酸，但這4 種地衣體表面均無豐富的粉芽[2,5,9,24]。

卡納皰衣Phlyctis karnatakanaS. Joshi &Upreti, Bryologist 113(4): 726 (2010)。

地衣體殼狀，樹皮生。子囊盤直徑為0.4~0.5μm,具有輕微粉霜，子囊棒狀，含有8 個孢子，子囊孢子透明，橫隔型，25~35μm×4~7μm，含有降斑點酸。

研究標本：云南，普洱市國家森林公園, 1 552 m,王欣宇CH130421 (KoLRI 020827)。

基物：樹皮。

分布：云南[2]。

討論：該種的子囊孢子具有7 個橫隔，與P.himalayensis和P. longifera(Nyl.) D. J. Galloway &Guzmán 相似，但后兩者具有較大的子囊孢子，分別為60~75μm×6~8μm 和55~86μm×5~7μm，且地衣體含有斑點酸[10,23]。該種在孢子橫隔型與P. uncinata和P. communisChitale & Makhija 相近，不同點在于P. uncinata的子囊孢子50~54μm×5~7μm, 具有8 個橫隔；P. communis的子囊孢子具有7~16 個橫隔，含有斑點酸和水楊嗪酸(salazinic acid)[25-26]。

裂皰皰衣Phlyctis schizosporaZahlbr., in Handel-Mazzetti, Symb. Sinic. 3: 178 (1930)

地衣體殼狀，灰色至淡灰綠色，子囊盤直徑0.3~0.6 mm；子囊棒狀，含有單孢；子囊孢子褐色，磚壁型，73~85μm×25~37μm。未檢測到地衣次生代謝產(chǎn)物。

研究標本：湖北，神農(nóng)架，2 900 m，魏江春和陳建斌10896 (HMAS-L)。

基物：竹子。

分布：湖北[7]。

討論：該種主要特征為地衣體不含地衣次生代謝產(chǎn)物，與本研究中的新記錄種P. subhimalayensis較為相似，但后者的子囊含有8 個孢子，且子囊孢子橫隔型，37~45μm×4~6μm[22]。

灰色皰衣Phlyctis speireaG. Merr., Ottawa Nat.27(9): 118(1913)

地衣體殼狀，子囊盤直徑0.3~0.5 mm，通常具有白色粉霜，子囊橢圓形，含有單孢或2 個孢子,子囊孢子無色透明，磚壁型，40~80μm×25~35μm,I-。含有降斑點酸。

研究標本：甘肅，文縣邱家壩，2 620 m，楊芳20070197、20070443、20070451 (SDNU)。

基物：樹皮。

分布：甘肅[2]。

討論：該種主要特征是子囊盤表面黑褐色, 具有白色粉霜，子囊單孢或2 個孢子，子囊孢子磚壁型，40~80μm×25~35μm，含有降斑點酸。該種與P. communisChitale & Makhija 較為相似，表面均呈灰色，具有白色粉霜，子囊盤埋生在地衣體中，但P. communis子囊含有8 個孢子，子囊孢子橫隔型，18~33(~45)μm×6~9μm，含有降斑點酸和水楊嗪酸[26]。

亞亮皰衣Phlyctis subargenaR. Ma & H. Y.Wang, Mycotaxon 114: 362 (2010)

地衣體殼狀。子囊盤直徑0.1~0.3 mm，通常3~8(~10)聚集在一起，盤面紅褐色，具有白色粉霜；子囊棒狀，含有2 個孢子；子囊孢子透明，磚壁型，42~78μm×30~42μm。含有降斑點酸。

研究標本：甘肅，文縣邱家壩，2 450 m，楊芳20070024、20070045、20070381 (SDNU)。

基物：樹皮。

分布：甘肅[9]。

討論：該種地衣體表面嚴重粉芽化，子囊含有2 個孢子，含有降斑點酸。皰衣屬中含有降斑點酸的物種有6 種，分別是：P.agelaea(Ach.) Flot.、P.chilensisD. J. Galloway & Guzmán、P. speireaG.Merr.、P. uncinataStirt.、P. argena(Ach.) Flot.和P.karnatakanaS. Joshi & Upreti，他們各具明顯不同特征：P.agelaea地衣體表面無粉芽；P. chilensis子囊單孢，子囊孢子磚壁型，(190~)230~270(~285)μm×55~70μm；P. speirea子囊單孢或2 個孢子，子囊孢子磚壁型，40~80μm×25~35μm；P. uncinata子囊8 個孢子，子囊孢子橫隔型，50~54μm×5~7μm;P.argena子囊盤較為稀少，子囊單孢，子囊孢子100~150μm×25~50μm[2,5,10,24-25]。

中國皰衣屬分種檢索表

1a. 子囊孢子磚壁型 ····································································································································· 2

1b. 子囊孢子橫隔型 ···································································································································· 5

2a. 地衣體含地衣次生代謝產(chǎn)物······················································································································ 3

2b. 地衣體未檢測到地衣次生代謝產(chǎn)物，子囊孢子73~85μm×25~37μm ··································· 裂皰皰衣P. schizospora

3a. 地衣體表面具有豐富的粉芽······················································································································ 4

3b. 地衣體表面無粉芽 ·········································································································· 灰色皰衣P. speirea

4a.子囊含2 個孢子，子囊孢子42~78μm×30~42μm ······························································· 亞亮皰衣P. subargena

4b.子囊含單孢子，子囊孢子100~150μm×25~50μm ······································································ 亮皰衣P. argena

5a. 子囊層I+紫紅色，子囊孢子100~120μm×10~15μm ······················································· 卡納皰衣P. karnatakana

5b. 子囊層I-，子囊孢子60~73μm×12~16μm ······················································類喜馬拉雅皰衣P. subhimalayensis

致謝感謝中國科學院微生物研究所菌物標本館的鄧紅高級實驗師在借閱標本方面提供幫助；中國科學院微生物研究所魏江春課題組的任強研究員提供樣品，魏鑫麗研究員對本文提出了寶貴建議。