菩提樹黑痣病菌生物學特性及病害發(fā)生規(guī)律

韋昌幸，黃宇豪，韋繼光，吳耀軍，羅輯

(1.廣西壯族自治區(qū)國有高峰林場，廣西南寧 530001；2.廣西大學農(nóng)學院，廣西南寧 530004；3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院，廣西南寧 530002)

菩提樹Ficus religiosa屬?？?Moraceae 榕屬Ficus常綠或半落葉喬木，樹高可達15 ～25 m。 葉革質(zhì)，三角狀卵形，先端聚尖，延長成披針狀條形尾，尾約占葉片長的1/4 ～1/3，榕果球形至扁球形，花期3—4 月，果期5—6 月[1]。 在我國主要種植于南方各省，如云南、廣東、廣西等地，多見于公園、寺廟等地作景觀植物，也有一些城市用于行道樹栽種[2]。 菩提樹黑痣病影響菩提樹的光合作用，導致葉片組織壞死，嚴重時造成大量落葉，影響菩提樹觀賞價值，經(jīng)濟效益降低[3]。 廣西地處低緯度，屬亞熱帶季風氣候，氣候溫暖，雨水豐沛，年平均降水量841.2 ～3 387.5 mm，年平均氣溫17.5 ～23.5 ℃，溫濕度符合菩提樹黑痣病的發(fā)病條件，是菩提樹黑痣病的多發(fā)地區(qū)。

黑痣菌Phyllachora repens(Corda) Sacc.屬于真菌界Fungi 子囊菌門Ascomycota 糞殼菌綱 Sordariomycetes 黑痣菌目 Phyllachorales 黑痣菌科Phyllachoraceae 黑痣菌屬Phyllachora的真菌[4]，是專性寄生的活體營養(yǎng)真菌，無法人工培養(yǎng)，導致對其研究受限。 至今僅見降香黃檀黑痣病的發(fā)生規(guī)律研究報道[5-6]。 目前對菩提樹的研究包括造林技術(shù)[1]、繁殖技術(shù)[7-8]、病害研究[2，9-10]、引種防寒技術(shù)[11]、傳粉生物學研究[12]、綠化作用[13-14]、藥學研究[15]等，但未見對菩提樹黑痣病的研究報道。

1 材料與方法

1.1 試驗地情況 廣西壯族自治區(qū)憑祥市綠化樹種菩提樹種植圃(N 22°6′38"，E 106°45′15")，菩提樹種植面積18 hm2，樹齡4 ～8 a。 該地區(qū)屬高溫多雨的亞熱帶季風型氣候，年平均氣溫 19.5 ～21.41 ℃，極端最高氣溫38.7 ℃，極端最低氣溫-1.2 ℃。 年活動積溫 7 124 ～7 836 ℃·d，無霜期約340 d。 4 月下旬進入雨季，持續(xù)到10 月上旬結(jié)束，6—8 月雨量集中，多大雨或暴雨天氣，10 月至翌年4 月雨量較少。

1.2 病原菌子囊孢子液制備 將葉片上的黑痣病病斑刮下，放入10 mL 離心管中研磨處理(非破壁處理)， 加 入 3 mL 無 菌 水， 渦 旋 震 蕩 3 min，4 000 r/min離心處理3 min，過濾多余雜質(zhì)，取上清液，8 000 r/min 離心 4 min，棄上清液，保留 1 mL 孢子沉淀液于離心管中備用。

1.3 菩提樹黑痣病發(fā)病規(guī)律 在試驗地內(nèi)設(shè)立3個樣地，每個樣地內(nèi)菩提樹30 株，每月從每株樹上隨機選取30 片葉子，調(diào)查黑痣病的發(fā)生情況，按照病害嚴重度分級標準(表1)計算病情指數(shù)并進行差異顯著性分析。

表1 菩提樹黑痣病的嚴重度分級標準Tab.1 The severity grade standard of tar spot of Ficus religiosa

以憑祥市氣象觀測中心數(shù)據(jù)為參考，從3 月份開始觀察記錄每日的晴雨情況，取其月平均值，根據(jù)3 個樣地的觀測數(shù)據(jù)，分析菩提樹黑痣病的發(fā)病率和病情指數(shù)及年變化規(guī)律與溫度、濕度、降水量的關(guān)系，并進行差異顯著性分析。

病情指數(shù)=[∑(病級株數(shù)×代表數(shù)值)/(總株數(shù)×發(fā)病最重級的代表數(shù)值)]×100。

1.4 室外子囊孢子的捕捉 制作木盒，木盒中間插入涂上醫(yī)用凡士林的載玻片，每盒放置7 塊。 每個樣地掛置1 個木盒，用于捕捉菩提樹黑痣病病原菌子囊孢子。 每月將木盒中載玻片取回，放在顯微鏡下以10 ×10 倍鏡觀察捕捉到子囊孢子數(shù)量，每塊載玻片上隨機選取5 個視野，取其平均值，得到1 個月內(nèi)每個區(qū)域所捕捉到的子囊孢子的相對數(shù)量。 結(jié)合田間調(diào)查，分析子囊孢子釋放量與菩提樹黑痣病的病情指數(shù)之間的關(guān)系[16-17]。

1.5 子囊孢子萌發(fā)的生物學特性測定 將純凈子囊孢子液滴入凹玻片的凹槽中，再分別放入8，10，13，15，17，20，22，25，27，30，32，35，38 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每個溫度設(shè)3 個重復，以無菌水滴入凹玻片作對照。 36 h 后計算每個玻片上的平均孢子萌發(fā)率，確定子囊孢子萌發(fā)最適溫度。

用98%濃硫酸在密閉干凈的干燥器中調(diào)節(jié)空氣相對濕度[18]。 將純凈子囊孢子液均勻涂抹于潔凈載玻片上，快速風干后，分別置于相對濕度為50%、65%、75%、85%、90%、95%、100% 的干燥器中，以孢子在100% ＋水膜中作為試驗對照，每個濕度條件分別設(shè)置3 個重復，在子囊孢子萌發(fā)最適宜溫度(25 ℃)培養(yǎng)36 h 后，利用光學顯微鏡鏡檢子囊孢子萌發(fā)情況，確定子囊孢子最適萌發(fā)濕度。

選取蔗糖、葡萄糖、乳糖3 種碳源，硝酸銨、硝酸鈉、氯化銨3 種氮源，分別配制成所需含碳量和含氮量溶液備用，碳源有效濃度40.0 ～42.5 g/L，氮源有效濃度2.59 ～2.78 g/L。 將純凈子囊孢子液分別與上述配制好的溶液混合，保證其混合后溶液濃度不變，將混合液充分混勻后滴至凹玻片上，不加入碳、氮源的孢子液作為空白對照，放入保濕器，再將保濕器放入恒溫箱中培養(yǎng)36 h，觀察孢子萌發(fā)情況，確定碳、氮源對子囊孢子萌發(fā)是否存在刺激作用。

1.6 室外接種試驗 將純凈子囊孢子液放入小噴壺中。 選取室外生長無病菩提樹5 株，處理組和對照組葉片都來自同一株樹，共5 個處理和對照。 對無病葉片用75%乙醇擦拭表面，后用無菌水清洗3次，晾干后分2 組處理。 第一組選擇10 片無病無傷葉片的半邊葉片噴灑子囊孢子液，另半邊葉片作空白對照，用封口袋保濕，3 d 后進行第1 次觀察；第二組選擇10 片無病葉片的一半葉面用昆蟲針輕輕刺破，然后再噴上孢子液，另半邊葉片作空白對照，用封口袋封口保濕，每3 d 觀察1 次，觀察其發(fā)病情況。 接種的子囊孢子液濃度為1 ×106個/mL，每片葉片接1 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情指數(shù)增長與子囊孢子捕捉的周年動態(tài)菩提樹黑痣病的發(fā)病規(guī)律與菩提樹生長季節(jié)是緊密相關(guān)的。 菩提樹的落葉期是每年的1—2 月，3 月菩提樹陸續(xù)長出新葉，新葉長出1 個月后開始出現(xiàn)典型病斑，在12 月至次年2 月不再長出新葉。 病情指數(shù)4—12 月呈上升趨勢，期間增長量有1 個峰值，出現(xiàn)在6 月，而4—8 月為病情指數(shù)增長較快期。 9—12 月病情指數(shù)增長量逐步下降，1—2 月菩提樹進入落葉期，病情指數(shù)增長量為0(圖1)。

圖1 菩提樹黑痣病病情指數(shù)增長量的年變化規(guī)律Fig.1 Yearly variation of disease increase index of tar spot of Ficus religiosa

菩提樹黑痣病的子囊孢子全年都在釋放和傳播，釋放量在6 月和10—11 月形成2 個明顯的高峰，且這2 個高峰期子囊孢子釋放量差異不顯著，其它各月子囊孢子釋放量相對較少，各月間的子囊孢子釋放量存在差異顯著性，1 月子囊孢子釋放量最小(圖2)。

圖2 菩提樹黑痣病每月孢子捕捉量的周年變化Fig.2 Yearly variation of monthly ascospore capture of tar spot of Ficus religiosa

2.2 氣象因子與孢子捕捉量及病情指數(shù)增長的關(guān)系 菩提樹黑痣病病情指數(shù)增長量與平均降水量和平均空氣相對濕度呈極顯著關(guān)系，與溫度變化呈顯著關(guān)系，與平均相對孢子捕捉量呈不顯著關(guān)系(表2)。 菩提樹黑痣病病情指數(shù)增長量在4—7 月間持續(xù)較高，可能與這個時期多雨、空氣相對濕度大以及菩提樹的嫩葉多有關(guān)系。 盡管8—9 月降水量還比較多，且相對濕度都在80%以上，但此時大多數(shù)葉片為成熟葉片，嫩葉的比例小，因此菩提樹黑痣病的病情指數(shù)增長變得緩慢。 10—12 月降水量相對減少，濕度下降，葉片以成熟葉為主，新發(fā)葉片很少，幼嫩葉片比例小，病害增長速度大大減緩。 病情指數(shù)增長量與子囊孢子的每月相對捕捉量沒有相關(guān)關(guān)系，這說明林地內(nèi)子囊孢子數(shù)量充足，不成為病情指數(shù)增長的制約因素。

表2 2017—2018 年菩提樹黑痣病發(fā)生與氣象因子和孢子捕捉量的關(guān)系Tab.2 The relationship between meteorological factors，ascospore capture and the severity of tar spot of Ficus religiosa in 2017—2018

2.3 病原菌生物學特性 黑痣菌子囊孢子萌發(fā)的溫度為15 ～35 ℃，最適溫度為 25 ℃(表 3)。 在廣西，每年3—11 月都能滿足子囊孢子萌發(fā)的溫度要求，不成為發(fā)病的限制因素。

表3 不同溫度對子囊孢子萌發(fā)的影響Tab.3 The effect of different temperature influenced ascospores germination

黑痣病菌子囊孢子萌發(fā)要求的最低空氣相對濕度為90%，濕度低于90%時孢子不萌發(fā)(表4)，因此濕度大有利于子囊孢子萌發(fā)。 在廣西每年6—8月進入雨季，空氣相對濕度大，有利于子囊孢子的萌發(fā)，進入秋季以后，雨水減少，空氣相對濕度較小，不利于子囊孢子萌發(fā)。

菩提樹黑痣病菌的子囊孢子在3 種不同的碳源刺激下，孢子萌發(fā)率與對照沒有明顯的差異(表5)，表明菩提樹黑痣病菌的子囊孢子萌發(fā)對這3 種碳源的刺激沒有明顯的反應(yīng)。 在硝酸鈉氮源的刺激下，菩提樹黑痣菌子囊孢子的萌發(fā)率顯著高于對照(表5)。

表4 不同空氣相對濕度對子囊孢子萌發(fā)的影響Tab.4 The effect of different relative humidity on ascospores germination

2.4 室外接種 5 月室外接種子囊孢子15 d后，接種葉片出現(xiàn)黃褐色小點，30 d 后黃褐色小點陸續(xù)變黑凸起，形成典型癥狀，經(jīng)形態(tài)學鑒定，接種后產(chǎn)生的子囊孢子與接種的子囊孢子一致。 無傷接種葉片形成黑痣典型癥狀的點數(shù)很多，傷口接種葉片形成黑痣典型癥狀的點數(shù)相對較少，同時，無傷接種的對照區(qū)也有少量幾個黑痣點，屬于自然感染(圖3)，推斷菩提樹黑痣病菌的侵入途徑與傷口關(guān)系不大，在自然條件下主要為直接侵染。 另外，菩提樹黑痣病的潛育期較長，從接種到出現(xiàn)典型癥狀時間為30 d。

圖3 室外接種子囊孢子15 d 后葉片癥狀Fig.3 The symptoms of leaf 15 days after inoculating ascospores outdoor

3 結(jié)論與討論

菩提樹黑痣病的發(fā)病規(guī)律與其生長季節(jié)緊密相關(guān)，病原菌的子囊孢子全年都在釋放和傳播，病情指數(shù)增長量受平均降水量、平均空氣相對濕度及溫度變化影響。 菩提樹黑痣病子囊孢子萌發(fā)受溫度、相對濕度影響較大，硝酸鈉可刺激子囊孢子的萌發(fā)。菩提樹黑痣病的潛育期較長，自然條件下侵染方式主要為直接侵染。

菩提樹黑痣菌寄主單一，張中義和張?zhí)沼涊d菩提樹黑痣病菌的寄主均為菩提樹[3]，本試驗對苗圃內(nèi)的20 多個樹種及苗圃周圍的12 個樹種進行了調(diào)查，除了菩提樹發(fā)生黑痣病外，僅發(fā)現(xiàn)降香黃檀Dalbergia odorifera也有黑痣病的發(fā)生，但經(jīng)切片觀察子囊孢子的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)降香黃檀黑痣病菌的子囊孢子與菩提樹黑痣病菌的子囊孢子形狀和大小有明顯的區(qū)別(不同種)，說明菩提樹黑痣病菌的寄主范圍較單一，對其他木本植物未構(gòu)成威脅。

1999 年菩提樹黑痣病在中國首次出現(xiàn)于臺灣地區(qū)[19]，本研究發(fā)現(xiàn)菩提樹黑痣病首次在中國大陸發(fā)生，病害的傳播可能與苗木調(diào)運有關(guān)，盡管此病害不屬于檢疫性有害生物，也要防止或減少病害的擴散，調(diào)運菩提樹苗木需謹慎，謹防攜帶黑痣病的苗木。