NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的定位和表達(dá)

范闊海，張敏愛，胡燕姣，劉藝，王慧榮，于秀菊*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，山西 晉中 030801；2.太原海關(guān)技術(shù)中心，山西 太原 030000；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

活化T 細(xì)胞c1 核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFATc1）是NFAT 家族成員之一，主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成和腫瘤的發(fā)生發(fā)展［1-2］，近年來的研究證實(shí)，NFATc1 表達(dá)于哺乳動(dòng)物多種組織中［3］，并且發(fā)現(xiàn)其在免疫系統(tǒng)和被皮系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。 相關(guān)研究表明：紫外線會(huì)降低NFATc1 的磷酸化水平，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加、膠原蛋白降解，從而引發(fā)皺紋的形成。Hwang 等研究證明，蕁麻、羽衣草和消皮素C 等藥物可以通過調(diào)控NFATc1 的轉(zhuǎn)錄水平從而降低紫外線對皮膚造成的傷害［4-6］。Hariri 等在對Axenfeld Rieger 綜合征患者進(jìn)行基因分析和表型變化的研究中發(fā)現(xiàn)，Nfatc1基因的突變會(huì)導(dǎo)致毛囊細(xì)胞的 退 化 和 汗 腺 的 缺 失［7］。 Horsley 等 制 備 的NFATc1 缺失型小鼠表現(xiàn)為毛發(fā)的過度生長，并對該現(xiàn)象的分子機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)NFATc1 具有維持毛囊干細(xì)胞保持靜止?fàn)顟B(tài)的生物學(xué)功能，NFATc1 的缺失導(dǎo)致毛囊干細(xì)胞被激活，毛囊始終處于生長時(shí)期，從而引發(fā)毛發(fā)生長過剩［8］。

毛囊作為皮膚中重要的附屬結(jié)構(gòu)，對于人和動(dòng)物都具有重要的意義。其生長呈現(xiàn)周期性的變化過程，大致分為3 個(gè)時(shí)期：毛囊生長期（Anagen）、退 化 期（Catagen）和 相 對 靜 止 期（Telogen）［9］。各種動(dòng)物的毛囊生長周期的時(shí)間長短不同，例如：小鼠的毛囊生長周期約為28 d［10］。毛囊的周期變化受到Hox 基因、角蛋白（Keratins）、βcatenin 等一系列的基因和蛋白的調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，毛囊的周期性變化與毛囊干細(xì)胞的激活與否有著密切的關(guān)系。截至目前，已經(jīng)證明的毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物有多種，主要包括CD34，還有Lhx2、Sox9、Tcf3、Nfatc1等轉(zhuǎn)錄因子［11-12］。前面的研究表明NFATc1 與毛囊干細(xì)胞具有密切的關(guān)系，但在小鼠自然毛囊生長周期性中的作用如何尚不清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)，熒光定量PCR 和Western blotting 技術(shù)對NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的組織定位、mRNA 和蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，探尋NFATc1 在小鼠毛囊周期性生長過程中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

20 只2 月齡的ICR 小鼠（屬于Swiss 小鼠，由美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research）的3個(gè)首字母命名，是國際通用的封閉群小鼠，具有繁殖力高、適應(yīng)性強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好的特點(diǎn)），雌雄各半，體重（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)條件為：溫度（23±1）℃，濕度為45%左右，自由采食和飲水。交配確定受孕后將雌鼠單獨(dú)飼喂，選擇同一天生產(chǎn)的5 窩小鼠，于出生后的第15 天（處于毛囊生長期），第19 天（處于毛囊退化期）和第21 天（處于毛囊相對靜止期），每窩取1 只小鼠，麻醉后取其背部皮膚，將其皮膚組織置于Bouins 固定液中固定24 h，70%～100%的梯度酒精脫水，1∶1 酒精與二甲苯處理后，二甲苯透明后浸蠟包埋，制成厚度為5 μm 的石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)分析；將其部分皮膚組織置于液氮中保存，按照Trizol 法和組織總蛋白抽提試劑盒的方法分別提取小鼠皮膚的總RNA 和總蛋白，用于熒光定量PCR 和Western blotting 檢測。兔抗NFATc1 多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；β-actin 多克隆抗體和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自寶生物（大連）工程有限公司，組織蛋白抽提試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)分析

制備好的石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，70%～100%的梯度酒精復(fù)水至蒸餾水；3%過氧化氫用于去除內(nèi)源性的過氧化物酶，PBS 洗3 次，每次5 min；5%非免疫性牛血清作為封閉液，37 ℃孵育30 min；去除封閉液后滴加1∶100 兔抗NFATc1 多克隆抗體，室溫孵育30 min，4 ℃過夜孵育，室溫孵育30 min；PBS 洗3 次，每次5 min，滴加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；滴加DAB 顯色劑顯色3 至5 min，PBS洗3 次，每次5 min；蘇木精輕度復(fù)染，70%～100%的梯度酒精脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。非免疫牛血清代替一抗作為陰性對照。

通過Image-Pro Plus 6.0 軟件對NFATc1 蛋白在小鼠皮膚組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行光密度的測定，每個(gè)時(shí)期的3 只小鼠皮膚組織切片中分別取5 個(gè)視野，獲得陽性細(xì)胞的光密度值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）來表示。

1.2.2 熒光定量PCR 分析

電泳檢測提取的小鼠皮膚總RNA 的完整性，ND-1000 超微量核酸蛋白測定儀測定其濃度并將各個(gè)樣本的濃度調(diào)至同一濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法完成cDNA 的合成。

根據(jù)NCBI 小鼠Nfatc1的基因序列，借助Primer5.0 軟件，設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR 檢測的特異性引物，并由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。引物序列為：Forward primer：5’-CCCGTCACATTCTGGTCC-3’，Reverse primer：5’-GCTGCCTTCCGTCTCATAG-3’。以合成cDNA 為模板，以特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR 分析，反應(yīng)在八連管中進(jìn)行。反應(yīng)體系為：TB Green Fast qPCR Mix（2×）12.5 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA 2 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.5 μL、加dH2O 至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃10 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本、Nfatc1基因、β-actin基因3 個(gè)重復(fù)。由熔解曲線判斷PCR 的特異性，根據(jù)熒光曲線獲得CT值，利用2-△△CT分析定量的結(jié)果。

1.2.3 Western blotting 檢測

BCA 法測定提取的小鼠皮膚總蛋白的濃度，并將各個(gè)樣品的蛋白濃度歸至同一濃度。每個(gè)樣品總蛋白上樣量為200 μg，在8%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜。PVDF 膜于5%脫脂蛋白粉封閉液中孵育1h，孵育一抗（1∶1000 兔抗NFATc1 多克隆抗體；1∶500 兔抗β-actin 多克隆抗體），室溫放置30 min，4 ℃孵育過夜，室溫放置1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min，孵育二抗（1∶10 000，HRP-山羊抗兔IgG），37 ℃孵育1 h。TBST洗膜4 次，每次10 min。運(yùn)用ECL 試劑盒進(jìn)行曝光之后對其信號(hào)條帶掃描。使用Image J 軟件對小鼠毛囊不同生長時(shí)期的皮膚組織中NFATc1 和β-actin 蛋白的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的定位

NFATc1 的免疫組化陽性反應(yīng)物主要分布于毛囊的膨大部、根鞘、皮脂腺和表皮，在毛囊生長的3 個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，但在不同的毛囊生長時(shí)期表達(dá)量存在差異。在毛囊的生長期，毛纖維生長茂盛，整個(gè)毛囊的長度不斷增長達(dá)到最長，毛囊乳頭直徑顯著大于根鞘部直徑，在毛囊的根鞘部、皮脂腺和表皮可見NFATc1 的陽性反應(yīng)物（圖1A）；毛囊進(jìn)入退化期，毛囊乳頭萎縮成杵形的圓狀結(jié)構(gòu)，整個(gè)毛囊的長度明顯變短，這個(gè)時(shí)期，在毛囊的膨大部、皮脂腺和表皮存在NFATc1 較強(qiáng)的陽性表達(dá)物（圖1B）；在短暫的退化期（小鼠3 d 左右）后毛囊進(jìn)入相對靜止期（圖1C）：毛芽生長，膨大部的干細(xì)胞不斷分化成內(nèi)根鞘和毛干向上推移，接近“杵形毛”，杵形毛最終脫落，從而新毛占據(jù)舊毛穴。在毛囊的相對靜止期，NFATc1 的陽性物主要是在毛囊的膨大部。對照組中均未見陽性反應(yīng)（圖1D～圖1F）。NFATc1 在毛囊生長期、退化期和相對靜止期的平均光密度值分別是0.17±0.012 0、0.48±0.014 7 和0.23±0.001 8。

圖1 NFATc1 在小鼠生長周期中的免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Immunohistochemistry of NFATc1 in the hair follicle cycle in mice

2.2 NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的基因表達(dá)差異分析

熒光定量PCR 的擴(kuò)增曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”形曲線，Nfatc1和β-actin基因的擴(kuò)增曲線平行性較好，拐點(diǎn)清楚，基線平而無上揚(yáng)情況。熔解曲線集中有2 個(gè)峰，表明Nfatc1和β-actin沒有產(chǎn)生引物二聚體，產(chǎn)物單一。Nfatc1基因在毛囊生長期、退化期和相對靜止期的mRNA 表達(dá)量變化分析結(jié)果顯示（圖2）：Nfatc1在毛囊生長期的mRNA 表達(dá)量最低；在毛囊退化期的mRNA 表達(dá)量顯著高于毛囊生長期和相對靜止期，是毛囊生長期的3.34 倍；毛囊相對靜止期，Nfatc1的mRNA 表達(dá)量有所下降，是生長期的2.3 倍。

與毛囊生長期比較，**P＜0.01，下同Compared with Anagen，**P＜0.01，The same below

2.3 NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的蛋白量差異分析

在小鼠毛囊的生長期、退化期和相對靜止期皮膚組織中各期小鼠皮膚中均存在與NFATc1 多克隆抗體結(jié)合的蛋白條帶，蛋白條帶的大小約為120 kDa，通過Image J 軟件對蛋白灰度值進(jìn)行分析得出，NFATc1 在小鼠毛囊生長的3 個(gè)時(shí)期的表達(dá)量存在差異，其蛋白在毛囊退化期的表達(dá)量顯著高于毛囊生長期和相對靜止期（圖3）。

圖3 NFATc1 在小鼠生長周期中的蛋白表達(dá)水平分析Fig.3 NFATc1 protein expression levels in in the hair follicle cycle in mice.

3 討論

毛發(fā)對于人和動(dòng)物都具有重要的作用。毛囊是毛發(fā)數(shù)量和生長所依賴的基本組織結(jié)構(gòu)單元［13］。毛囊作為皮膚中的特有器官，毛囊發(fā)育形成后，其上半部分在出生后是恒定不變的，稱之為“永久部”；而毛囊的下半部分處于循環(huán)變化之中，稱之為“循環(huán)部”。根據(jù)毛囊生長過程中的結(jié)構(gòu)特征將其大致分為：毛囊生長期、毛囊退化期和毛囊相對靜止期［14］。毛囊的周期性變化呈現(xiàn)為毛纖維的生長和脫落。本研究結(jié)果顯示：小鼠處于生長期的毛囊形態(tài)為毛乳頭增大，干細(xì)胞被激活，毛根鞘分化增殖，毛干不斷增長；進(jìn)入退化期的小鼠毛囊，毛乳頭萎縮，該時(shí)期干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，根鞘增殖停止，小鼠毛囊退化期為3 天左右；在短暫的退化期后小鼠毛囊進(jìn)入相對靜止期，在該階段毛發(fā)容易脫落，毛囊干細(xì)胞被活化，毛囊乳頭不斷增大，根鞘生長旺盛，新的毛發(fā)不斷向上生長將舊的毛發(fā)頂至脫落，占據(jù)舊毛穴［15-16］，毛囊進(jìn)入了下一個(gè)毛囊生長周期。毛囊生長周期包括增殖、分化、遷移以及凋亡等一系列過程，并受多種生長因子、細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)肽和藥物的影響和調(diào)控［17］。近年來研究證實(shí)：毛囊的再生依賴于毛囊干細(xì)胞在毛發(fā)周期的相對靜止期向生長期過渡過程中的激活［18］，這個(gè)過程受到內(nèi)在和環(huán)境因素的嚴(yán)格控制。毛囊干細(xì)胞位于毛囊的膨大部（Bulge），它可分化產(chǎn)生毛基質(zhì)的祖細(xì)胞，進(jìn)而分化向上推移，形成毛囊的內(nèi)根鞘和毛干。隨著基質(zhì)細(xì)胞的分化，膨大部的毛囊干細(xì)胞在毛囊生長期處于一個(gè)短暫的對稱自我更新階段，最后在退化期再次回到靜止?fàn)顟B(tài)［19］。Hu 等報(bào)道，源于毛乳頭的Wnt 信號(hào)和BMP 信號(hào)與毛囊的生長有關(guān)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路通過激活毛囊干細(xì)胞從而在毛生長過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，BMP 信號(hào)通路抑制毛囊干細(xì)胞的激活，而TGF-β2 信號(hào)可以拮抗BMP 促進(jìn)毛囊的再生。這兩個(gè)信號(hào)通路均通過β-catenin、TCF、LEF1 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)來激活或抑制毛囊干細(xì)胞的激活［20］。

Blanpain 等在研究中觀察到轉(zhuǎn)錄因子Nfatc1在毛囊的基底細(xì)胞和膨大部的表達(dá)存在顯著的差異。Yamamoto 等發(fā)現(xiàn)，器官移植過程中使用免疫抑制藥物環(huán)孢霉素A（CSA）后，機(jī)體表現(xiàn)為毛發(fā)生長加快，并在進(jìn)一步研究該現(xiàn)象的機(jī)制中證實(shí)，CSA 抑制了鈣依賴磷酸酶的表達(dá)，該酶的減少導(dǎo)致Nfatc1 的表達(dá)量降低，從而毛發(fā)表現(xiàn)為生長加快的現(xiàn)象［21］。大量研究表明，Nfatc1 表達(dá)量的降低或是基因缺失，會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)的過度生長。Gafter-Gvili 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出“NFAT 蛋白在毛囊周期中的退化階段發(fā)揮著重要的作用”［22］。本實(shí)驗(yàn)對NFATc1 蛋白在小鼠毛囊生長周期中的定位進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示NFATc1 蛋白主要定位于毛囊的膨大部，在根鞘、皮脂腺和表皮也有表達(dá)，且NFATc1 蛋白在毛囊退化期的膨大部呈強(qiáng)陽性表達(dá)，NFATc1 蛋白的陽性反應(yīng)定位于毛囊干細(xì)胞的定殖部位吻合，由此得出：NFATc1 蛋白在毛囊干細(xì)胞維持靜止?fàn)顟B(tài)中發(fā)揮著重要的作用。Horsley 等在敲除NFATc1 小鼠模型研究中也發(fā)現(xiàn)NFATc1 具有維持毛囊干細(xì)胞保持靜止?fàn)顟B(tài)的生物學(xué)功能，NFATc1 的缺失會(huì)導(dǎo)致毛囊干細(xì)胞被激活，毛囊始終處于生長時(shí)期，從而表現(xiàn)毛發(fā)生長過剩［8］。進(jìn)一步對NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的基因和蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析，熒光定量PCR和western blotting 的結(jié)果顯示，NFATc1 在毛囊退化期的mRNA 表達(dá)量和蛋白表達(dá)量最高，且顯著高于在毛囊生長期和相對靜止期的表達(dá)量。

4 結(jié)論

本研究對NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的組織定位和基因蛋白表達(dá)量差異進(jìn)行分析，結(jié)果證明，NFATc1 的表達(dá)量與毛囊干細(xì)胞的活性呈負(fù)相關(guān)，該因子具有抑制小鼠毛囊干細(xì)胞的激活的作用，在小鼠毛囊的周期性生長過程中發(fā)揮著重要的作用，為全面揭示毛發(fā)周期性生長的分子調(diào)控機(jī)制提供了理論支持。