亞精胺通過抑制音猬因子信號通路減輕心肌膠原沉積和氧化應激作用*

王莉，劉敏

(江漢大學附屬醫(yī)院老年醫(yī)學研究所，武漢 430014)

人口老齡化是全球性公共衛(wèi)生問題[1]。第7次全國人口普查數(shù)據(jù)顯示，我國正步入老齡化社會。衰老是隨著年齡遞增而出現(xiàn)細胞、組織和器官生理功能與內環(huán)境穩(wěn)態(tài)紊亂的現(xiàn)象，因此也被認為是多種疾病的重要危險因素[2]。衰老性疾病，尤其是心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)嚴重危害老年人群的健康[3]。據(jù)報道，CVDs(包括高血壓、心肌肥大和心力衰竭等)占全世界死亡人數(shù)的約31%[4]，已經成為造成老年人死亡的主要原因之一[1]。

器官纖維化是一種伴隨衰老和組織損傷的生理現(xiàn)象，以細胞外基質(extracellular matrix，ECM)重構造成膠原沉積為常見特征，是人類衰老相關疾病發(fā)病和死亡的關鍵誘因[5-6]。其中，心臟纖維化常見于高血壓、心肌梗死和心力衰竭等[7]。纖維化過程參與了包括心臟在內的大多數(shù)器官疾病的發(fā)病機制。目前尚無有效的針對性治療方法[6]。

刺猬(hedgehog，HH)信號通路參與細胞分化、增殖和衰老等多種生物學過程，尤其在心肌細胞發(fā)育和心血管系統(tǒng)形成等方面發(fā)揮重要的調節(jié)作用[8]。其中音猬因子(sonic hedgehog，SHH)是HH家族中表達最為廣泛的成員，其與受體結合后活化跨膜蛋白Smoothened(SMO)并最終促進GLI蛋白的轉移和表達，干預下游靶基因行為從而參與細胞活性和組織穩(wěn)態(tài)的調節(jié)[9]。亞精胺是一種廣泛存在于日常膳食營養(yǎng)中的天然多胺，其在人體組織中的含量隨著年齡的增長而下降[10]。研究顯示，亞精胺具有改善心肌線粒體功能、抑制細胞凋亡、防治心肌梗死等活性[11]。筆者研究亞精胺對心肌膠原沉積和氧化應激的改善作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 亞精胺(含量>99%，批號：S107071)、D-半乳糖(D-galactose，D-gal)(含量>99%，批號：D274314)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。SHH(批號：00041772)、SMO(批號：10007493)和GLI-1(批號：10010981)抗體購于武漢三鷹生物技術有限公司。SMO激動劑SAG(批號：16561)購于美國MCE公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，q-PCR)檢測試劑盒SYBR FAST qPCR Master Mix(批號：KM4101)購于美國KAPA Biosystems公司。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(vimentin，VIM)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)以及膠原COL1A1和COL3A1引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp，批號：20200808)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC，批號：20200804)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號：20200808)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，批號：20200808)、過氧化氫酶(catalase，CAT，批號：20200804)和丙二醛(MDA，批號：20200804)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。大鼠心肌細胞H9c2購于中國科學院細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與給藥 H9c2 細胞于達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco's minimum essential medium ，DMEM)中培養(yǎng)。設置亞精胺梯度濃度(1，5，10，20，50，100和200 μmol·L-1)干預組，另平行操作空白培養(yǎng)基等體積干預設置為正常對照組。24 h后CCK-8法檢測吸光度(A值)計算細胞存活率，相對存活率=(A給藥孔-A培養(yǎng)基孔)/(A正常對照孔-A培養(yǎng)基孔)。

1.2.2細胞模型建立 與正常對照組比較，1～50 μmol·L-1亞精胺孵育并未顯著影響H9c2 細胞存活率。然而，100和200 μmol·L-1亞精胺孵育則顯著降低了H9c2 細胞存活率，提示50 μmol·L-1以上的干預濃度可能具有細胞毒性。因此選擇20和50 μmol·L-1亞精胺孵育濃度進行后續(xù)實驗。采用50 mol·L-1D-gal孵育H9c2細胞[12]，隨機分為4組：模型對照組、20 μmol·L-1亞精胺組、50 μmol·L-1亞精胺組和50 μmol·L-1亞精胺+3 nmol·L-1SHH信號通路激動劑組(SAG組)。24 h后CCK-8法檢測細胞存活率。

1.2.3比色法檢測生化指標 H9c2細胞按“1.2.2”項操作后，參照試劑盒說明書檢測各組細胞Hyp、T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT和MDA的水平。

1.2.4流式檢測細胞內活性氧水平 H9c2細胞按“1.2.2”項操作后，用10 μmol·L-1DCFH-DA孵育細胞，碘化丙啶(propidium iodide，PI) 染色排除死亡細胞干擾。流式細胞儀檢測細胞平均熒光強度評價細胞活性氧(reactive oxgen species，ROS)水平。

1.2.5q-PCR檢測mRNA水平 H9c2細胞按“1.2.2”項操作后，參照SYBR FAST qPCR Master Mix說明書步驟，通過q-PCR檢測COL1A1、COL3A1、E-cad、α-SMA、VIM、FN和TGF-β1的mRNA水平。引物序列見表1。GAPDH為內參。

表1 q-PCR引物序列 Tab.1 Primer sequences for q-PCR

1.2.6免疫印跡法(Western blotting)檢測蛋白表達 采用Western blotting檢測SHH信號通路節(jié)點蛋白SHH、SMO和GLI-1的表達量。經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離總蛋白后，依次轉膜、封閉、抗體孵育。采用全自動化學發(fā)光分析儀檢測電化學發(fā)光(electrochemilumine-scence，ECL)，通過TANONGIS軟件記錄灰度值。

2 結果

2.1亞精胺對H9c2 細胞存活率的影響 與正常對照組比較，D-gal孵育顯著降低H9c2 細胞的存活率。與模型對照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著升高細胞的存活率。與50 μmol·L-1亞精胺單獨干預比較，SAG組H9c2 細胞的存活率顯著降低。見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與正常對照組比較，t=2.328，P<0.05；②與正常對照組比較，t=3.791，P<0.01；③與模型對照組比較，t=-9.829～-4.035，P<0.01；④與50 μmol·L-1亞精胺組比較，t=2.731，P<0.05。圖1 各組H9c2 細胞的存活率A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with normal control group，t=2.328，P<0.05；②Compared with normal control group，t=3.791，P<0.01；③Compared with model control group，t=-9.829—-4.035，P<0.01；④ Compared with 50 μmol·L-1spermidine group，t=2.731，P<0.05.Fig.1 The viability of H9c2 cells in each

2.2亞精胺對H9c2細胞氧化應激的影響 H9c2細胞氧化應激通過流式檢測細胞ROS水平，比色法檢測細胞T-AOC、脂質過氧化水平(MDA)和抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活力綜合評價。與正常對照組比較，D-gal孵育顯著升高了H9c2細胞的ROS和MDA水平，降低T-AOC能力，并抑制了SOD、GSH-Px和CAT的酶活力。與模型對照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著升高細胞的T-AOC和抗氧化酶活力，降低ROS和MDA水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨干預比較，SAG組細胞ROS和MDA含量顯著升高，T-AOC，SOD和CAT水平降低。見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對照組比較，T-AOC，t=-21.138～-10.273；SOD，t=-15.076～-6.314；GSH-Px，t=-11.508～-5.294；CAT，t=-31.15～-6.711；MDA，t=7.807～27.069；ROS，t=6.237～12.522，均P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，T-AOC，t=2.69，P<0.05；③與50 μmol·L-1亞精胺組比較，SOD，t=3.195；CAT，t=3.654；MDA，t=-4.271；ROS，t=-2.432，均P<0.01。圖2 各組H9c2 細胞氧化應激檢測結果A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，T-AOC，t=-21.138—-10.273；SOD，t=-15.076—-6.314；GSH-Px，t=-11.508—-5.294；CAT，t=-31.15—-6.711；MDA，t=7.807-27.069；ROS，t=6.237-12.522，all P<0.01.②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，T-AOC，t=2.69，P<0.05；③Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，SOD，t=3.195；CAT，t=3.654；MDA，t=-4.271；ROS，t=-2.432，P<0.01.Fig.2 Oxidative stress levels of H9c2 cells in each

2.3亞精胺對H9c2細胞膠原沉積的影響 通過檢測細胞Hyp含量、膠原COL1A1和COL3A1以及TGF-β1的mRNA水平評價心肌膠原沉積情況。與正常對照組H9c2細胞的Hyp含量(0.100±0.018 )μg·L-1比較，模型對照組H9c2細胞的Hyp含量升高至(0.236±0.019) μg·L-1(t=10.556，P<0.01)。與模型對照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺顯著降低Hyp含量至(0.180±0.014)和(0.144±0.015) μmol·L-1(t=4.802，7.720，P<0.01)。與50 μmol·L-1亞精胺組比較，SAG組Hyp含量升高至(0.156±0.019 )μmol·L-1(t=-1.007，P<0.01)。與正常對照組比較，D-gal顯著升高COL1A1、COL3A1和TGF-β1的mRNA水平。與模型對照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著降低COL1A1、COL3A1和TGF-β1的mRNA水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨干預比較，SAG組顯著升高COL1A1、COL3A1和TGF-β1的mRNA水平。見圖3。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對照組比較，TGF-β1，t=7.241～25.052；COL1A1，t=9.777～32.327，；COL3A1，t=4.363～15.39，均P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，TGF-β1，t=-4.117；COL1A1，t=-6.594；COL3A1，t=-3.426，均P<0.01。圖3 各組H9c2 細胞TGF-β1、COL1A1和COL3A1的 mRNA水平A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，TGF-β1，t=7.241-25.052；COL1A1，t=9.777-32.327；COL3A1，t=4.363—15.39，all P<0.01.②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，TGF-β1，t=-4.117；COL1A1，t=-6.594；COL3A1，t=-3.426，all P<0.01.Fig.3 The mRNA levels of TGF-β1，COL1A1 and COL3A1 in each group of H9c2

2.4亞精胺對H9c2細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響 通過檢測EMT標記物E-cad、α-SMA、VIM和FN的mRNA水平綜合評價細胞EMT情況。與正常對照組比較，D-gal孵育顯著降低了H9c2細胞E-cad的mRNA水平，升高了α-SMA、VIM和FN的mRNA水平。與模型對照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺顯著升高E-cad的mRNA水平，降低了α-SMA、VIM和FN的mRNA水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨干預比較，SAG組E-cad的mRNA水平顯著降低，α-SMA和FN的mRNA水平升高。見圖4。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對照組比較，E-cad，t=-18.149～-4.482；α-SMA，t=4.792～17.796；VIM，t=4.046～16.765；FN，t=3.429～14.305，均P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，E-cad，t=1.961，α-SMA，t=-2.997，P<0.05。③與50 μmol·L-1亞精胺組比較，t=-3.939，P<0.01。圖4 各組H9c2細胞E-cad、α-SMA、VIM和FN的mRNA水平A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，E-cad，t=-18.149—-4.482；α-SMA，t=4.792-17.796；VIM，t=4.046-16.765；FN，t=3.429—14.305，all P<0.01.②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，E-cad，t=1.961；α-SMA，t=-2.997，all P<0.05.③Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，t=-3.939，P<0.01.Fig.4 The mRNA levels of E-cad，α-SMA，VIM and FN in each group of H9c2

2.5亞精胺對H9c2細胞SHH信號通路的影響 SHH信號通路的活躍程度通過檢測節(jié)點蛋白SHH、SMO和GLI-1的表達量評價。與正常對照組比較，D-gal孵育顯著升高了H9c2細胞SHH、SMO和GLI-1的表達水平。與模型對照組比較，20和50 μmol·L-1亞精胺能夠顯著降低細胞SHH、SMO和GLI-1的表達水平。與50 μmol·L-1亞精胺單獨干預比較，SAG組細胞SHH、SMO和GLI-1的表達水平顯著升高。見圖5。結合前文結果，亞精胺減輕心肌膠原沉積的作用機制可能與抑制SHH信號通路和氧化應激有關(圖6)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.50 μmol·L-1亞精胺組；D.20 μmol·L-1亞精胺組；E.SAG組。①與模型對照組比較，SHH，t=7.923～22.332；SMO，t=6.302～22.620；GLI-1，t=6.307～22.218，P<0.01。②與50 μmol·L-1亞精胺組比較，SHH，t=-2.755；GLI-1，t=-2.054，P<0.05。③與50 μmol·L-1亞精胺組比較，t=-10.242，P<0.01。圖5 各組H9c2細胞SHH、SMO和GLI-1蛋白表達水平A.normal control group；B.model control group；C.50 μmol·L-1 spermidine group；D.20 μmol·L-1 spermidine group；E.SAG group.①Compared with model control group，SHH，t=7.923—22.332；SMO，t=6.302—22.620；GLI-1，t=6.307—22.218，all P<0.01；②Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，SHH，t=-2.755；GLI-1，t=-2.054，P<0.05.③Compared with 50 μmol·L-1 spermidine group，t=-10.242，P<0.01.Fig.5 The protein expression levels of SHH，SMO and GLI-1 in each group of H9c2

圖6 亞精胺的作用機制 Fig.6 Mechanisms of spermidine

3 討論

膠原沉積是器官纖維化的關鍵病理特征[11]。因此，心肌膠原沉積也是心臟纖維化導致心肌結構和功能破壞的病理原因之一，將加速心肌梗死、肥厚型心肌病和心臟衰竭等疾病的進展[13]。H9c2心肌細胞株來源于大鼠心臟，被廣泛應用于CVDs的研究中，尤其適用于衰老相關性疾病的防治研究[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺能夠有效改善D-gal誘導的H9c2細胞的膠原沉積，提示亞精胺具有減緩衰老引起的心臟纖維化的潛力。

EMT是器官纖維化形成的核心途徑之一，在分子水平上表現(xiàn)為上皮標記物E-cad逐漸缺失，間質標記物VIM、α-SMA和FN等過表達。一方面，E-cad對維持細胞正常黏附連接至關重要。E-cad缺失和VIM過表達將導致細胞骨架重組并獲得運動能力。另一方面，α-SMA的陽性表達是成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，進而促進ECM重構和膠原沉積的標志性事件之一[16]。此外，TGF-β是強力的促纖維化細胞因子，與α-SMA和VIM等EMT指針的過表達密切相關[13]。TGF-β1能夠下調E-cad，上調α-SMA和FN的表達，促進H9c2細胞EMT[17]。本研究證實，亞精胺改善心肌膠原沉積的效應與抑制TGF-β1和EMT有關。

氧化應激是心肌損傷的誘因之一。正常生理狀態(tài)下，體內抗氧化體系負責維持細胞內ROS的產生與消除處于動態(tài)平衡。各種因素導致的抗氧化酶活力被抑制，都將引起體內抗氧化防御體系的破壞，造成ROS聚集，最終出現(xiàn)氧化應激損傷[15]。SHH信號通路參與衰老相關的細胞氧化應激[18]。事實上，各種細胞信號通路存在廣泛的交連，而SHH信號通路處于關鍵的節(jié)點位置[19]。SHH信號通路的活躍能夠通過誘導其下游靶標TGF-β、EMT轉錄因子和膠原基因等表達而連接TGF-β、促纖維化效應、EMT程序和膠原沉積等生理活動[20]。氧化應激的形成將協(xié)同SHH信號通路進一步加速器官纖維化進程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，亞精胺能夠顯著抑制H9c2細胞的氧化應激、EMT和SHH信號通路。而SHH信號通路激動劑SAG在一定程度上抵消了亞精胺的上述作用。綜上所述，亞精胺能夠通過抑制SHH信號通路減輕心肌膠原沉積和氧化應激，提示亞精胺具有改善心臟衰老的潛在應用價值。筆者在下一步研究中將在體內水平予以深入探討。