色素上皮衍生因子對(duì)視網(wǎng)膜X 射線損傷的保護(hù)作用

朱 冉 丁伯洋 李文艷 李 婕 劉芬菊 陳新建 俞家華

1（蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院 蘇州 215123）

2（放射醫(yī)學(xué)與輻射防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘇州 215123）

3（蘇州大學(xué)電子信息學(xué)院 蘇州 215006）

色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，PEDF）是由418 個(gè)氨基酸組成的分泌型糖蛋白，分子量為50 kDa，屬于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族成員，因首次在視網(wǎng)膜色素上皮（Retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)而得名，其在心、腦、肝、腎、肺、骨等組織廣泛表達(dá)，具有多種活性功能，如營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、抗血管生成、抗氧化、抗炎癥與抗腫瘤功能［1-4］。在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)敲除PEDF可加重誘導(dǎo)性和遺傳性的視網(wǎng)膜變性［5］，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也表明外源性給予PEDF可以有效保護(hù)RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞［6-7］，說明眼部的PEDF 對(duì)于維持視網(wǎng)膜的正常功能、抵御外界損傷因素具有重要作用。

放射性視網(wǎng)膜病變常見于葡萄膜黑色素瘤與鼻咽癌放療后，是導(dǎo)致患者視力損傷和眼球萎縮的重要原因，主要的病理學(xué)改變是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、黃斑水腫、視網(wǎng)膜變性壞死，目前尚無(wú)特異性療法，臨床主要治療手段是采用糖皮質(zhì)激素抗炎與抗血管生成因子，但對(duì)于視力損傷的療效并不理想［8-9］。本研究旨在研究PEDF 對(duì)視網(wǎng)膜輻射損傷的作用，我們選用了人RPE 細(xì)胞ARPE-19，在抑制PEDF功能后檢測(cè)了X射線對(duì)ARPE-19細(xì)胞的損傷作用，接著分析了PEDF 上第44～77 位的34 個(gè)氨基酸片段（PEDF-34）對(duì)視網(wǎng)膜X 射線損傷的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果能為臨床防治放射性視網(wǎng)膜病變提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

杜氏改良Eagle：F12 培養(yǎng)基（DMEM：F12）（美國(guó)Hyclone）；胎 牛 血 清（FBS）（以 色 列BI）；Atglistatin（ATG）（美 國(guó)Selleck）；溴 烯 醇 內(nèi) 酯（Bromoenol lactone，BEL）（美國(guó)Sigma）；CCK-8 試劑盒與蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Lipofectamine RNAiMAX Reagent（美國(guó)Invitrogen）；PEDF siRNA(siRNA1：正義 鏈5'-GCGAACAGAAUCCAUCAUUTT-3'，反 義鏈 5'-AAUGAUGGAUUCUGUUCGCTT-3'；siRNA2： 正 義 鏈 5'-GCAGUGGGUAACAAAGUUUTT-3'，反 義 鏈5'-AAACUUUGUUACCCACUGCTT-3'；siRNA3：正義鏈5'-CCGGAAGCAUGAGUAUCAUTT-3'，反 義 鏈5'-AUGAUACUCAUGCUUCCGGTT-3'；陰 性 對(duì) 照siRNA： 正 義 鏈 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反 義 鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3')由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；RNA小量抽提試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara）；Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR 引物（PEDF：正 向5'-TTCAAAGTCCCCGTGAACAAG-3'，反 向5'-GAGAGCCCGGTGAATGATGG-3'；GAPDH：正向 5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，反 向 5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'）由上海生工生物工程有限公司合成；PEDF ELISA試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司）；PEDF-34由南京晨胎生物科技有限公司合成；眼球固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與照射

ARPE-19 細(xì)胞購(gòu)自北京中生奧邦生物科技有限公司，采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素與100 μg/mL 鏈霉素的DMEM：F12 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。細(xì)胞照射采用RS-2000 Pro 型X 射線輻照儀（美國(guó)Rad Source），管電壓為160 kV，管電流為25 mA、劑量率為1.1 Gy/min，劑量率采用指型電離室標(biāo)定。

1.3 CCK-8細(xì)胞活力測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19 細(xì)胞，以4 000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板中，待X 射線處理48 h 后每孔加入10 μL CCK-8溶液并孵育2 h，采用Synergy 2酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）測(cè)定450 nm的吸光度，以空白對(duì)照組的吸光度定為100%細(xì)胞活力。

1.4 siRNA轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，以20 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板中，過夜培養(yǎng)貼壁，采用Lipofectamine RNAiMAX Reagent 轉(zhuǎn) 染 siRNA（25 pmol/每孔），繼續(xù)培養(yǎng)2 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

細(xì)胞總RNA 采用RNA 小量抽提試劑盒提取，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系：5 倍的反應(yīng)緩沖液2 μL（含dNTP、Mg2+）、逆轉(zhuǎn)錄酶混合物0.5 μL（含RNA 酶抑制劑）、Oligo dT 引物25 pmol、總RNA 500 ng、用純水補(bǔ)足體積到10 μL。反應(yīng)條件：先37 ℃、15 min，后85 ℃、5 s。

1.6 熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系：上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2 μL、2 倍的Talent qPCR PreMix 10 μL、正向引物6 pmol、反 向 引 物6 pmol、50 倍ROX 參 考 染 色0.4 μL、用純水補(bǔ)足體積到20 μL。采用ViiA7熒光定量PCR 儀（美國(guó)Life Technologies）進(jìn)行擴(kuò)增分析，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃3 min、PCR 40個(gè)循環(huán)，每循環(huán)95 ℃5 s、60 ℃15 s。相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCt法，以GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照，陰性對(duì)照siRNA 轉(zhuǎn)染組表達(dá)為1。

1.7 ELISA測(cè)定PEDF濃度

ARPE-19 細(xì)胞siRNA 轉(zhuǎn)染2 d 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 取上層培養(yǎng)基，4 ℃1 000×g離心20 min，采用PEDF ELISA試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定，PEDF標(biāo)準(zhǔn)品倍稀釋后與樣本分別加入ELISA微孔板，37 ℃孵育90 min，用洗滌液洗板2次，每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入辣根過氧化物酶-鏈霉親和素偶聯(lián)物工作液，37 ℃孵育30 min，洗板5 次，加入顯色液，37 ℃孵育15 min，加入終止液后采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度。將標(biāo)準(zhǔn)濃度與相應(yīng)吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本PEDF濃度。

1.8 PEDF蛋白結(jié)構(gòu)可視化

PEDF 蛋白結(jié)構(gòu)文件下載于Molecular Modeling Database（PDB ID：1IMV），采用PyMol 2.3.5軟件進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)的可視化。

1.9 小鼠視網(wǎng)膜輻射損傷模型

6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，將PEDF-34溶于醫(yī)用生理鹽水，終濃度為2 nmol/L。小鼠隨機(jī)分為三組：空白對(duì)照組、20 Gy照射組和20 Gy照射與PEDF-34處理組。照射前使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，采用小動(dòng)物放射治療模擬定位機(jī)X-RAD SmART（美國(guó)Precision）設(shè)左右兩野對(duì)穿照射小鼠眼部，圓形準(zhǔn)直器直徑5 mm，管電壓225 kV，管電流13 mA，每野各照射10 Gy X 射線，采用儀器內(nèi)置平板探測(cè)器進(jìn)行劑量測(cè)定。照射結(jié)束后于SPF 動(dòng)物房飼養(yǎng)，PEDF-34處理組每天在小鼠眼球滴加PEDF-34溶液2 μL，其余兩組滴加生理鹽水，滴加處理4周后繼續(xù)飼養(yǎng)，于照射8 周后取眼球固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色與TUNEL染色。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，p<0.05 表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制PEDF 功能對(duì)APRE-19 細(xì)胞輻射損傷的作用

作為一種分泌型糖蛋白，PEDF 通過與相應(yīng)的受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，PEDF 受體抑制劑ATG或BEL 可阻斷其受體的信號(hào)傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抑制PEDF的功能［10-11］。圖1顯示4 Gy X射線輕微降低了ARPE-19 細(xì)胞的活力，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，預(yù)處理10 μmol/L ATG 或1 μmol/L BEL 2 h，再處理X 射線可顯著降低細(xì)胞活力，與各自單純藥物處理組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示抑制PEDF 功能可以增強(qiáng)X 射線對(duì)ARPE-19細(xì)胞的損傷作用。

圖1 PEDF受體抑制劑聯(lián)合X射線處理對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的作用；*p<0.05，**p<0.01Fig.1 Effects of PEDF receptor inhibitors and X-ray on the cell viability of ARPE-19 cells;*p<0.05,**p<0.01

2.2 降低PEDF 表達(dá)對(duì)APRE-19 細(xì)胞輻射損傷的作用

為降低ARPE-19 細(xì)胞中PEDF 的表達(dá)，我們針對(duì)PEDF基因序列設(shè)計(jì)了三對(duì)siRNA，轉(zhuǎn)染2 d后提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR分析。圖2（a）顯示三對(duì)siRNA 均可降低PEDF 的mRNA 表達(dá)水平，其中siRNA-1 效果最佳，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ELISA證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNA-1能夠顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中的PEDF 濃度（圖2（b）），說明ARPE-19 細(xì)胞分泌PEDF 受到了抑制。siRNA-1 轉(zhuǎn)染ARPE-19 細(xì)胞2 d后處理4 Gy X射線，結(jié)果表明，siRNA-1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力顯著低于陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組（圖2（c））。

圖2 降低PEDF表達(dá)對(duì)ARPE-19細(xì)胞輻射損傷的作用：(a)三對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)PEDF mRNA水平的作用；(b)ELISA檢測(cè)siRNA-1轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基中PEDF的濃度；(c)siRNA-1轉(zhuǎn)染聯(lián)合X射線對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的作用；*p<0.05，**p<0.01Fig.2 Effects of PEDF downregulation on the radiationinduced damage of ARPE-19 cells:(a)effects of three siRNA duplexes transfection on the PEDF mRNA levels;(b)PEDF concentration in the medium measured by ELISA after transfection of siRNA-1;(c)effects of siRNA-1 transfection and X-ray on the cell viability of ARPE-19 cells;*p<0.05,**p<0.01

2.3 PEDF-34對(duì)APRE-19細(xì)胞輻射損傷的作用

PEDF中保守的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白結(jié)構(gòu)域中包括10 個(gè)α 螺旋和3 個(gè)β 折疊，PEDF-34 是PEDF上從第44 位天冬氨酸（Aspartic acid，D）到第77 位的天冬氨酰（Asparagine，N）的含34 個(gè)氨基酸的多肽，覆蓋了1 個(gè)α 螺旋。圖3（a）用紅色顯示了其在PEDF 蛋白結(jié)構(gòu)中的位置和氨基酸序列。PEDF-34可通過滴眼直接進(jìn)入眼球后方，在視網(wǎng)膜處達(dá)到足夠的濃度，無(wú)需損傷性玻璃體注射，無(wú)需特殊溶劑載帶，具有神經(jīng)保護(hù)和抗血管生成作用［12-13］。圖3（b）顯示10 pmol/L PEDF-34預(yù)處理2 h的細(xì)胞活力顯著高于單純照射組，說明PEDF-34預(yù)處理對(duì)X射線引起的ARPE-19細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖3 PEDF-34對(duì)ARPE-19細(xì)胞輻射損傷的保護(hù)作用：(a)PEDF的蛋白結(jié)構(gòu)及PEDF-34的氨基酸序列；(b)PEDF-34預(yù)處理后X射線照射引起的ARPE-19細(xì)胞活力變化；*p<0.05(彩色見網(wǎng)絡(luò)版)Fig.3 Protective effects of PEDF-34 on ARPE-19 cells:(a)the protein structure of PEDF and the amino acid sequence of PEDF-34;(b)pretreatment of PEDF-34 altered the cell viability of ARPE-19 cells damaged by X-ray;*p<0.05(color online)

2.4 小鼠視網(wǎng)膜輻射損傷模型的構(gòu)建與組織學(xué)觀察

為了研究PEDF-34 在體內(nèi)對(duì)視網(wǎng)膜輻射損傷的作用，采用小動(dòng)物放射治療模擬定位機(jī)對(duì)C57BL/6J 小鼠眼部設(shè)置左右照射野，分別照射10 Gy。圖4（a）顯示了兩個(gè)照射野在矢狀面、水平面、冠狀面CT圖像上的投影，可見兩眼均在照射野范圍內(nèi)。照射后每天用含2 nmol/L PEDF-34的生理鹽水滴眼處理4 周，繼續(xù)飼養(yǎng)4 周后取眼球進(jìn)行HE 染色；圖4（b）顯示20 Gy處理組的RPE細(xì)胞層增厚和結(jié)構(gòu)異常與感光層的分界略有不清，內(nèi)核層與外核層結(jié)構(gòu)略有異常，而PEDF-34 處理組保持了正常的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，提示PEDF-34對(duì)X射線誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖4 PEDF-34滴眼處理對(duì)小鼠視網(wǎng)膜輻射損傷模型的作用：(a)左右照射野在矢狀面、水平面、冠狀面的投影；(b)小鼠視網(wǎng)膜HE染色Fig.4 Effects of PEDF-34 eye drops on radiation-induced retinal injury in mouse model:(a)median sagittal section,transverse section,and coronal section of the left and right irradiation fields;(b)HE staining of the mouse retina

2.5 PEDF-34處理對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的作用

TUNEL 染色顯示20 Gy 照射組的小鼠視網(wǎng)膜外核層中存在凋亡細(xì)胞，而在空白對(duì)照組與PEDF-34 處理組中未觀察到凋亡細(xì)胞（圖5）。外核層主要由感光細(xì)胞胞體組成的，說明20 Gy 照射可以誘導(dǎo)感光細(xì)胞發(fā)生凋亡，PEDF-34 處理可抑制感光細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 TUNEL染色檢測(cè)PEDF-34滴眼處理對(duì)小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的作用Fig.5 Effects of PEDF-34 eye drops on retinal cell apoptosis detected by TUNEL staining

3 討論

在眼部和頭頸部腫瘤放射治療中，如眼球正常組織受到過量電離輻射照射，會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞變性壞死、血供障礙，進(jìn)而引發(fā)病理性血管生成，最終導(dǎo)致視覺障礙［14］。在視網(wǎng)膜中，PEDF主要由RPE細(xì)胞分泌，具有保護(hù)感光細(xì)胞、抗氧化、抗炎、抗血管生成作用，本研究在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中初步研究了PEDF 對(duì)視網(wǎng)膜輻射損傷的保護(hù)作用，在ARPE-19細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)處理PEDF 受體抑制劑或降低PEDF 表達(dá)可加重X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)眼部局部處理含PEDF-34 的生理鹽水能緩解視網(wǎng)膜損傷，提示PEDF 及其多肽片段對(duì)于放射性視網(wǎng)膜病變具有一定的保護(hù)作用。

研究表明，PEDF 能維持RPE 細(xì)胞［6］、脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞［15］、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞［16］、感光細(xì)胞［17］等多種視網(wǎng)膜細(xì)胞的正常功能，外源性給予PEDF 可防治糖尿病視網(wǎng)膜病變［3］、光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，PEDF 的功能缺失使體外培養(yǎng)的RPE 細(xì)胞更易受到輻射損傷，而給予PEDF-34 可提高輻射抵抗性。RPE 細(xì)胞具有吞噬光感受器外段、促進(jìn)視網(wǎng)膜代謝、保持離子與電生理穩(wěn)態(tài)的功能，對(duì)于保持視網(wǎng)膜正常功能和血-視網(wǎng)膜屏障完整性具有重要意義。在小鼠模型中，20 Gy X射線照射8周后，RPE細(xì)胞層出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)異常，可能使視網(wǎng)膜支持能力受損、血-視網(wǎng)膜屏障破壞，是電離輻射誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜損傷的病理基礎(chǔ)。PEDF-34 滴眼是無(wú)損的眼部藥物輸送方法，可以使眼球后部達(dá)到有效的濃度［13］，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，PEDF-34 滴眼可以減輕RPE 細(xì)胞層的病理改變，并減少視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡。

目前對(duì)于PEDF保護(hù)RPE細(xì)胞對(duì)抗電離輻射的分子機(jī)制尚不明確，有研究證實(shí)，PEDF具有抗凋亡功能，可降低視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷時(shí)多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)與活化［6］。在過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，PEDF 可 激 活ERK1/2 與PI3K/Akt 通 路、抑 制p38/MAPK 信號(hào)、維持線粒體功能，從而降低活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷［19］。此外，PEDF還可抑制視網(wǎng)膜病變過程中腫瘤壞死因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β與單核細(xì)胞趨化蛋白等炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)［20］。PEDF與其多肽片段的視網(wǎng)膜輻射損傷保護(hù)能力可能與其抗凋亡、抗氧化、抗炎的功能有關(guān)。有研究表明，氧化應(yīng)激損傷引起RPE細(xì)胞的死亡方式較為復(fù)雜，壞死與鐵死亡可能都參與了RPE 細(xì)胞的損傷過程［21-22］，這兩種死亡方式是否參與PEDF對(duì)RPE細(xì)胞的防護(hù)作用需要進(jìn)一步的研究明確。

4 結(jié)論

PEDF 受體抑制劑處理或降低PEDF 表達(dá)可增強(qiáng)X 射線對(duì)APRE-19 細(xì)胞的損傷作用，給予PEDF-34 多肽片段對(duì)X 射線引起的ARPE-19 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，20 Gy X射線照射后視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，外核層含有凋亡細(xì)胞，PEDF-34 多肽片段滴眼處理組能夠保持視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)且無(wú)凋亡細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了PEDF 對(duì)X 射線誘導(dǎo)RPE 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，證實(shí)了PEDF-34 多肽片段對(duì)視網(wǎng)膜X 射線損傷有一定的防治功能，為研發(fā)治療放射性視網(wǎng)膜病變的方法提供了新的思路。PEDF 其他活性多肽片段是否也具有同樣的效果及其內(nèi)在分子機(jī)制仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證與研究。

作者貢獻(xiàn)說明 朱冉是本研究工作的主要執(zhí)行者，負(fù)責(zé)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與小鼠模型實(shí)驗(yàn)，并完成論文初稿寫作；丁伯洋協(xié)助體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，負(fù)責(zé)細(xì)胞活力的測(cè)定；李文艷負(fù)責(zé)蛋白與多肽的結(jié)構(gòu)分析；李婕負(fù)責(zé)組織學(xué)實(shí)驗(yàn)；劉芬菊參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與論文撰寫；陳新建指導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜損傷模型的構(gòu)建與鑒定；俞家華負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果分析，論文撰寫與修改。全體作者均已閱讀并同意最終的文本。