固定化酶/細(xì)胞用于功能糖生物制造的研究進(jìn)展

張佳旭，儲子儀，吳振華，石家福

（天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

功能糖是一類糖類碳水化合物，具有一系列獨特的功效，包括低熱量、降血糖、抗齲齒、改善腸道菌群等，在醫(yī)藥與食品安全領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[1-2]。作為蔗糖的重要取代物，功能糖具有巨大的市場發(fā)展?jié)摿?。功能糖工業(yè)化生產(chǎn)已成為新型生物制造產(chǎn)業(yè)鏈之一。大力發(fā)展綠色生物制造，應(yīng)堅持綠色、交叉、創(chuàng)新、協(xié)調(diào)發(fā)展?；诿复呋图?xì)胞催化的生物法合成功能糖路徑契合綠色生物制造的基本內(nèi)涵。為解決生物法中酶或細(xì)胞不能重復(fù)利用、穩(wěn)定性差的問題，越來越多的固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)被開發(fā)應(yīng)用于功能糖生物制造。本文對用于功能糖生物制造的固定化酶或固定化細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為功能糖的綠色生物制造提供一定的參考。

1 功能糖

功能糖主要包括功能性單糖、功能性低聚糖、功能性糖醇等。功能性單糖是一類具有獨特功效的單糖，包括甘露糖、阿洛酮糖、塔格糖、氨基葡萄糖等。一些單糖例如果糖，可通過腸壁吸收進(jìn)身體，進(jìn)入血流并儲存起來。如果儲存的時間足夠長，某些碳水化合物將會轉(zhuǎn)變成脂肪。而功能性單糖如D-阿洛酮糖，對脂肪肝酶有抑制作用，可阻止體內(nèi)脂肪的堆積，對腸道α-糖苷酶有抑制作用，可抑制血糖濃度的升高。功能性低聚糖是指通過糖苷鍵將2個～10個單糖連接形成的直鏈或支鏈的低度聚合糖，包括異麥芽低聚糖、低聚果糖等。功能性低聚糖在進(jìn)入大腸后會直接被雙歧桿菌所利用，不會在人體腸胃道內(nèi)被消化吸收[3]。功能性糖醇是含有2個以上羥基的多元醇類甜味劑，由相應(yīng)糖分子上的醛基或酮基還原成羥基可得到糖醇，包括甘露醇、異麥芽酮糖醇、赤蘚糖醇等。

目前功能糖的合成方法主要有化學(xué)法和生物法。較為常見的化學(xué)法為關(guān)環(huán)轉(zhuǎn)換合成法和兩步合成法，其存在反應(yīng)條件苛刻、副產(chǎn)物多、產(chǎn)率較低、環(huán)境污染等問題。生物法通過酶催化轉(zhuǎn)化合成功能糖。由于具有反應(yīng)條件溫和、特異性高、可持續(xù)性、環(huán)境友好等優(yōu)點[4]，近年來，越來越多基于生物法合成功能糖的路徑被開發(fā)并投入工業(yè)應(yīng)用。

2 功能糖的合成路徑

基于生物法合成功能糖的路徑主要分為單酶/多酶催化合成路徑和全細(xì)胞催化合成路徑兩類。單酶催化合成路徑的底物與產(chǎn)物單一，而多酶催化合成路徑通過級聯(lián)方式控制多個酶發(fā)生一系列反應(yīng)，實現(xiàn)由低價值化學(xué)品到高價值功能糖的定向、高效、連續(xù)轉(zhuǎn)換[5]。全細(xì)胞催化合成路徑將全細(xì)胞、組織甚至個體作為催化劑，利用胞內(nèi)酶進(jìn)行催化。與酶催化相比，全細(xì)胞催化省去酶的純化操作，從而降低經(jīng)濟成本。功能糖的合成路徑?jīng)Q定了后續(xù)固定化技術(shù)中涂層的設(shè)計和制備。固定化酶材料的設(shè)計與制備需要考慮催化酶自身性質(zhì)，如酶的尺寸、酶的最適溫度、最適pH值等。固定化細(xì)胞材料的設(shè)計與制備需要考慮細(xì)胞自身性質(zhì)，如細(xì)胞膜/壁的組成成分、細(xì)胞的最適溫度、最適pH值等。

常用功能糖的單酶/多酶催化合成路徑見表1。

表1 常用功能糖的單酶/多酶催化合成路徑Table 1 Single-enzyme/multi-enzyme catalyzed synthetic pathways for commonly used functional sugars

目前功能糖的合成路徑傾向于選擇廉價易得、安全無毒的淀粉、葡萄糖、果糖等作為底物，選擇轉(zhuǎn)化率高的催化反應(yīng)路徑用于功能糖生物制造。常用功能糖的全細(xì)胞催化合成路徑見表2。

表2 常用功能糖的全細(xì)胞催化合成路徑Table 2 Whole-cell catalyzed synthetic pathway for commonly used functional sugars

作為常見的構(gòu)建酶表達(dá)重組細(xì)胞，大腸桿菌具備易培養(yǎng)、生長快、重組體穩(wěn)定等優(yōu)點，但含有內(nèi)毒素，不能用于食品生產(chǎn)。與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌由于無外膜，其分泌的蛋白質(zhì)可以直接擴散到培養(yǎng)基中，且枯草芽孢桿菌為食品級，不含內(nèi)毒素。釀酒酵母也具有易培養(yǎng)、生長快等特點，但其存在基因表達(dá)低、發(fā)酵時間長等不足。與其他微生物相比，谷氨酸棒桿菌可以同時利用多種碳源，且對芳香族化合物的耐受性更高[39]。

2.1 D-阿洛酮糖的合成路徑

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體，甜度約為蔗糖的70%[40]，熱量值為0.007 kcal/g，能量為蔗糖的0.3%[41-42]。2014年，D-阿洛酮糖被正式批準(zhǔn)為一般公認(rèn)安全，可添加在食品、膳食補充劑以及醫(yī)藥制劑中[43]。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶家族是一種催化酮單糖C-3位置使其發(fā)生異構(gòu)化的酶，能夠催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖，包括D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶[44]，D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶[45]，酮糖3-差向異構(gòu)酶[46]。其中，D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的反應(yīng)中具有最高的效率，在2006年由Kim等[47]首次發(fā)現(xiàn)。通過使用D-葡萄糖異構(gòu)酶和D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來源于瘤胃菌），可從520 g/L的D-葡萄糖和380 g/L的D-果糖中獲得135 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為15%[7]。通過使用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來源于根癌農(nóng)桿菌），可從700 g/L的D-果糖中獲得230 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為32.9%[8]。D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來源于珀氏解黃酮菌）在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)。通過使用經(jīng)過透化處理的重組谷氨酸棒桿菌，可從750 g/L的D-果糖中獲得235 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為31% 、353 g/（L·h）[28]。此外，最新的研究發(fā)現(xiàn)，通過熱力學(xué)驅(qū)動的磷酸化/去磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，使用幾種嗜熱酶可從10、50 g/L的麥芽糊精（淀粉衍生物）中分別獲得48.5、217.8 mmol/L的D-阿洛酮糖，產(chǎn)率分別為88.2% 和79.2%[10]。

2.2 D-甘露糖的合成路徑

D-甘露糖是D-葡萄糖的C-2差向異構(gòu)體，甜度約為蔗糖的60%[48]。D-甘露糖異構(gòu)酶[11]、D-來蘇糖異構(gòu)酶[12，49]、D-甘露糖 2-差向異構(gòu)酶[13]和纖維二糖 2-差向異構(gòu)酶[14]可將D-葡萄糖或D-果糖轉(zhuǎn)化為D-甘露糖，具有實現(xiàn)D-甘露糖大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。通過使用纖維二糖2-差向異構(gòu)酶（來源于極端嗜熱纖維素降解菌），可從500 g/L的D-葡萄糖中獲得75 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為15% 、25 g/（L·h）[14]。通過使用來蘇糖異構(gòu)酶（來源于斯氏普魯菲登菌），可從600 g/L的D-果糖中獲得150 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為25% 、75 g/（L·h）[49]。與來蘇糖異構(gòu)酶（來源于斯氏普魯菲登菌）相比，甘露糖異構(gòu)酶（來源于大腸桿菌）可得到相同的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率[11]。通過使用來蘇糖異構(gòu)酶（來源于海洋嗜熱桿菌），可從400 g/L的D-果糖中獲得101.6 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為25.4% 、11.28 g/（L·h）[12]。通過兩種D-甘露糖2-差向異構(gòu)酶（分別來源于飄軟古字狀菌和雙歧桿菌），可從500 g/L的D-葡萄糖中分別獲得122、114 g/L的D-甘露糖，轉(zhuǎn)化率分別為24.4% 、22.8% ，產(chǎn)率分別為2.54、2.38 g/（L·h）[13]。

2.3 D-塔格糖的合成路徑

D-塔格糖甜度約為蔗糖的92% ，熱量為蔗糖的38%[50]。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶能夠催化D-山梨糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，在20世紀(jì)90年代由Saburi等[20]首次發(fā)表。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶也可用于催化D-半乳糖合成D-塔格糖[51]。D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)中通常使用乳糖作為廉價原料，在偏酸性條件下水解為D-半乳糖，進(jìn)而酶法合成D-塔格糖。通過使用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（來源于植物乳桿菌）可兩步法催化牛奶乳清粉中的乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，從140 g/L乳糖的牛奶乳清粉中獲得51.5 g/L的D-塔格糖，產(chǎn)率為0.54 g/（L·h）[17]。通過使用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（來源于植物乳桿菌WU14）生產(chǎn)D-塔格糖，轉(zhuǎn)化率為69.6%[18]。

3 固定化技術(shù)

酶自身存在最適pH值、最適溫度等約束條件，這對于實際工業(yè)操作是不利的。固定化酶/細(xì)胞后可提高酶的耐用性，擴大酶/細(xì)胞的適用范圍。高溫可抑制細(xì)菌的外來污染，提高反應(yīng)速率，但對于游離酶，高溫會直接降低酶活，影響酶的催化效率，對于細(xì)胞，高溫會引起細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的通透性發(fā)生變化，進(jìn)而發(fā)生酶損壞或酶泄露，最終導(dǎo)致全細(xì)胞催化效率降低。固定化技術(shù)解決了這一問題，通常在固定化酶或固定化細(xì)胞后，酶的熱穩(wěn)定性提高，即可以在更高溫度下保持活性，有利于功能糖的連續(xù)高效生產(chǎn)[52]。

3.1 固定化酶

酶固定化技術(shù)指將酶限制在不同于底物和產(chǎn)物存在的固體載體或基質(zhì)上[53]。固定化酶的方法可分為吸附法（將酶吸附在載體上）、包埋法（將酶在載體內(nèi)部封裝）、交聯(lián)法（酶不額外使用載體自固定）和共價法（載體上活潑的反應(yīng)基團(tuán)和酶形成共價鍵）[54]。相比游離酶，固定化酶可以循環(huán)使用，易于從反應(yīng)體系中分離，因此生產(chǎn)成本降低。另外，固定化酶的穩(wěn)定性通常高于游離酶，比如能夠耐受一定高溫，pH值耐受范圍變廣。但在固定化過程中可能存在一定的問題，如酶活損失，還有某些酶經(jīng)固定化后底物特異性發(fā)生改變，這可能與底物結(jié)合口袋的變化有關(guān)[55]。為了解決這些問題，應(yīng)針對不同種類酶的反應(yīng)條件選擇合適的載體和固定化方法，調(diào)控優(yōu)化固定化條件。用于合成功能糖的固定化酶載體主要為天然高分子材料（海藻酸鈉[16，56]、殼聚糖[26，57-59]等）、合成高分子材料（離子交換樹脂[49，60-61]、環(huán)氧樹脂[62-63]、聚丙烯腈[64]、聚乙烯醇[27，65]等）、納米材料（有機-無機雜化納米花[66]、氧化石墨烯[67-68]、納米纖維素[69-70]、磁性納米粒子[23，61]等）。

3.1.1 天然高分子材料

海藻酸鈉是一種天然高分子多糖，成本低廉且具有良好的生物相容性，常被用于固定化酶領(lǐng)域。通過滴加法或乳化法，海藻酸鈉分子鏈段中的羧基可以與多價陽離子（通常為鈣離子）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使溶膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)。海藻酸鈉通常與戊二醛共固定化酶，防止包埋在海藻酸鈣微球中的酶泄漏。戊二醛作為交聯(lián)劑，可用于連接酶和載體，但其戊二醛對酶蛋白具有一定的毒性，需控制戊二醛用量，減少對酶活的抑制作用。通過海藻酸鈉與戊二醛的包埋-交聯(lián)法，孫玉英等[56]對殼聚糖酶和β-D-氨基葡萄糖苷酶混合液進(jìn)行固定，用于從殼聚糖中獲得D-氨基葡萄糖，固定化酶的酶活為38.5% 。Rai等[16]通過同樣方法對L-阿拉伯糖異構(gòu)酶進(jìn)行固定，用于生產(chǎn)D-塔格糖。在40℃～60℃下，固定化酶的酶活能保留在80% 以上。在填充床反應(yīng)器中循環(huán)使用6次后，轉(zhuǎn)化率可達(dá)90% 以上，第7次轉(zhuǎn)化率降低至63% ，第8次轉(zhuǎn)化率降低至44% 。

殼聚糖由甲殼素形成，甲殼素作為地球上存量最多的氨基多糖，主要分布于甲殼動物的殼中、真菌細(xì)胞壁等地方。殼聚糖帶有大量活性氨基，屬于陽離子聚電解質(zhì)，可通過靜電吸附作用與陰離子聚電解質(zhì)發(fā)生聚集現(xiàn)象[71]。李曉波等[57]通過殼聚糖固定D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，并在填充床中利用固定化酶持續(xù)轉(zhuǎn)化D-果糖為D-阿洛酮糖。固定化酶的酶活回收率可達(dá)45% ，且在填充床中反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為24% 、6.7 g/（L·h），在反應(yīng)168 h后，轉(zhuǎn)化率仍然能保留13% 以上。將吸附與交聯(lián)法相結(jié)合，耿夢華等[58]通過殼聚糖與戊二醛的吸附-交聯(lián)法固定蔗糖異構(gòu)酶（來源于重組短小芽孢桿菌）。固定化酶的酶活回收率最高可達(dá)70.3% ，異麥芽酮糖的產(chǎn)率達(dá)到87.8% 。固定化酶循環(huán)使用16次后，產(chǎn)率仍能保留87.52% 。Chen等[26]通過同樣方法固定α-葡萄糖苷酶（來源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌），該固定化酶可與其他成本相對較低的游離酶和淀粉共同作為底物用于生產(chǎn)異麥芽低聚糖。納米二氧化硅比表面積大，富含羥基基團(tuán)，可由正硅酸乙酯的溶膠-凝膠過程形成，用于固定化酶領(lǐng)域[72]。納米二氧化硅形成過程中，正硅酸乙酯水解生成硅羥基，硅氧基團(tuán)之間會發(fā)生縮聚反應(yīng)最終形成高度網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)。王艷君等[59]通過殼聚糖與正硅酸乙酯形成的溶膠-凝膠雜化載體與戊二醛固定殼聚糖酶，用于生產(chǎn)氨基葡萄糖。固定化酶在4℃條件下，酶半衰期約為28 d，循環(huán)使用10次后，酶活損失小于30% 。

3.1.2 合成高分子材料

常用于固定化酶的樹脂主要為離子交換樹脂和環(huán)氧樹脂。離子交換樹脂具備較高的機械強度，且樹脂的粒徑基本在 300 μm～800 μm，適合裝柱，利于固定化酶與反應(yīng)液的后續(xù)分離，但是固定化基本依賴于離子交換作用，酶負(fù)載少且在不利環(huán)境中易解吸。Li等[60]通過陰離子交換樹脂D301固定D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶（來源于重組短小芽孢桿菌），用于從D-果糖中獲得D-阿洛酮糖。固定化酶的酶活為（24.06±0.80）U/g載體，產(chǎn)率為（90.0±2.8）% ，將其循環(huán)使用10次后，酶活仍能保留約70% 。Park等[49]通過使用Duolite樹脂A568固定D-來蘇糖異構(gòu)酶（來源于斯氏普魯菲登菌），可從300 g/L的D-果糖中獲得75 g/L的D-甘露糖，23個周期后轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為25% 、75g/（L·h）。金輝[61]通過強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂Amberlite FPA90 Cl固定D-甘露糖異構(gòu)酶，固定化酶的酶活為19.21 U/g載體，將其循環(huán)使用8次后，酶活保留80.8% 。

環(huán)氧樹脂不僅具有機械強度高、固定化酶易于從反應(yīng)體系中分離的優(yōu)點，也解決了離子交換樹脂易解吸的問題。環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基可與酶蛋白表面的基團(tuán)（如氨基、巰基）反應(yīng)會形成牢固的共價鍵，酶穩(wěn)定不易解吸。Torres等[62]將β-半乳糖苷酶、L-阿拉伯糖異構(gòu)酶和D-葡萄糖異構(gòu)酶單獨固定并共同固定在環(huán)氧樹脂Eupergit C和Eupergit C 250 L上，用于生產(chǎn)塔格糖。具有共固定化穩(wěn)定三酶系統(tǒng)的單反應(yīng)器工藝可實現(xiàn)完全乳解，產(chǎn)生45% 的D-塔格糖和39% 的D-果糖，D-塔格糖產(chǎn)率為9.5 g/（L·h）～10 g/（L·h），可循環(huán)使用至少12次。Bu等[63]采用離子交換、共價結(jié)合、戊二醛交聯(lián)法，將D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶固定在環(huán)氧樹脂Reli Zyme HFA403/M上，固定化酶的酶活為103.48 U/g載體。引入甘氨酸使甘氨酸的氨基與固定化酶殘余的環(huán)氧基、醛基發(fā)生反應(yīng)，可阻斷殘余基團(tuán)與酶蛋白的進(jìn)一步結(jié)合，控制過度共價結(jié)合。在循環(huán)使用8次后，未經(jīng)甘氨酸阻斷和經(jīng)甘氨酸阻斷的固定化酶的酶活分別保留89.98% 和105.43% 。

聚丙烯腈是一種由85% 以上丙烯腈與第二、第三單體聚合而成的高分子聚合物[73]，穩(wěn)定性好、膜易形成、成本低廉，常用于工業(yè)化生產(chǎn)的分離過程。婁倩芳等[64]通過聚丙烯腈吸附將海藻糖合酶固定，可用于生產(chǎn)海藻糖。在40℃、pH7.4和底物濃度為200 g/L條件下生產(chǎn)海藻糖，固定化酶在循環(huán)使用6次后，酶活仍保留64.4% 。聚乙烯醇作為另一種水溶性高分子聚合物，由于其可生物降解性、高機械穩(wěn)定性等優(yōu)勢被應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域[74]。聚乙烯醇與海藻酸鈉共固定化酶可彌補海藻酸鈉強度較低、熱穩(wěn)定性差、酶泄漏率大的缺點。通過聚乙烯醇-海藻酸鈉固定重組蔗糖異構(gòu)酶，固定化酶的酶活回收率為82.4% ，可催化蔗糖產(chǎn)生620.7 g/L的異麥芽酮糖，反應(yīng)13個批次后轉(zhuǎn)化率仍能保持90% 以上[65]。蔗糖異構(gòu)酶固定在聚乙烯醇-海藻酸鈉上，也可用于催化甜菜糖蜜生產(chǎn)異麥芽酮糖。固定化酶的酶活回收率為82.4% ，反應(yīng)8個批次后轉(zhuǎn)化率仍能保留97.5% ，異麥芽酮糖濃度為（446.4±5.5）g/L（純度 85.8% ）[27]。

3.1.3 納米材料

納米材料作為一種新型的固定化酶載體，因其比表面積大、表面易于修飾、與酶分子尺寸相近等優(yōu)點，具有潛在的應(yīng)用價值[75]。納米材料可通過是否具有磁性來分類。用于合成功能糖的非磁性納米材料種類較多，Zheng等[66]使用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶作為有機成分，磷酸鈷作為無機成分，制備有機-無機雜化納米花，用于從D-果糖中獲得D-阿洛酮糖。在60℃和pH8.5條件下，納米花的酶活為36.2 U/mg，比游離酶高約7.2倍，在循環(huán)使用6次后酶活仍能保留90% 。氧化石墨烯作為基于石墨烯的納米材料，具有高比表面積、出色的熱穩(wěn)定性和機械性能[76]。Zhang等[67]通過氧化石墨烯固定蔗糖異構(gòu)酶（來源于歐文氏菌屬），用于從蔗糖中獲得異麥芽酮糖。在40℃和pH6.0條件下反應(yīng)180 min后，轉(zhuǎn)化率為95.3% ，在循環(huán)反應(yīng)10個批次后，酶活仍能保留80% 左右。通過氧化石墨烯固定D-阿洛酮3-差向異構(gòu)酶（來源于根癌農(nóng)桿菌），在60℃條件下固定化酶的半衰期為720 min，約是游離酶的180倍，且可循環(huán)使用10次[68]。Gennari等[69]分別使用微晶纖維素、堿性納米纖維素和酸性納米纖維素對β-半乳糖苷酶進(jìn)行固定，用于合成低聚半乳糖。3種固定化酶的酶活分別達(dá)到 106.88、115.03、108.47 IU/g載體。通過物理吸附將β-半乳糖苷酶固定在埃洛石（一種鋁硅酸鹽納米材料）上[70]，將埃洛石吸附酶包裹在硫酸化細(xì)菌纖維素納米晶體的多孔基質(zhì)中，進(jìn)一步提高穩(wěn)定性。在25℃條件下，固定化酶在反應(yīng)60 d后，酶活仍能保留75.8% ，而游離酶的酶活僅保留29.2% 。Ran等[77]通過功能化聚羥基脂肪酸納米粒子固定D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶（來源于重組無內(nèi)毒素大腸桿菌），用于從D-果糖中獲得D-阿洛酮糖。固定化酶的酶活高達(dá)649.3 U/g載體，但粒徑僅為50 nm～200 nm，需要依賴離心的方式將固定化酶從反應(yīng)體系中分離。

磁性納米材料通過共價結(jié)合法固定化酶，在外部磁場的作用下解決了后續(xù)操作中酶難以分離回收的問題。Panek等[23]通過戊二醛活化的硅烷化磁性氧化亞鐵將重組海藻糖合酶固定，用于從麥芽糖中獲得海藻糖。固定化酶在循環(huán)反應(yīng)12次后，酶活仍能保留82% 。金輝[61]通過殼聚糖改性的磁性四氧化三鐵納米粒子將D-甘露糖異構(gòu)酶固定，用于從D-果糖中獲得D-甘露糖。固定化酶在循環(huán)反應(yīng)6個批次后，酶活保留26.19% 。反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行11 h后，D-甘露糖的濃度達(dá)到最大值76.64 g/L。

3.2 固定化細(xì)胞

不同于化學(xué)法和傳統(tǒng)酶催化法，全細(xì)胞催化法合成功能糖無需補充昂貴的輔因子，也無需酶的純化和分離，可大大降低成本，具有底物來源廣、反應(yīng)無污染、產(chǎn)物純度高的優(yōu)點。固定化細(xì)胞是指利用物理或化學(xué)的方法（吸附法、包埋法、共價法和交聯(lián)法）將細(xì)胞固定在一定材料中，從而促進(jìn)細(xì)胞回收和再循環(huán)[78]。20世紀(jì)90年代，固定化細(xì)胞被首次用于工業(yè)生產(chǎn)，固定化大腸桿菌實現(xiàn)了L-天冬氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)[79]。固定化細(xì)胞載體有無機載體（硅藻土[80]、多孔玻璃[81]等）、有機載體（海藻酸鈉[82]、殼聚糖[52]、晶膠介質(zhì)[83]等）、復(fù)合載體（聚乙烯醇-海藻酸鈉[84]、硅藻土-海藻酸鈉[85]、海藻酸鈉-二氧化鈦[86]等），其中復(fù)合載體為兩種固定方法共同作用，例如吸附-交聯(lián)法、吸附-包埋法[87]。

作為常用的細(xì)胞固定方法，基于海藻酸鈉的包埋法操作較為簡便。將菌懸液與海藻酸鈉溶液混合后，向溶液中滴入氯化鈣溶液，即得到含有菌體的海藻酸鈣微球，這種方法得到的固定化細(xì)胞再利用率提高了37.3%[88]。張煊鈞[82]通過海藻酸鈉包埋重組菌，用于生產(chǎn)D-塔格糖。反應(yīng)時間為36h，底物濃度150g/L時，固定化細(xì)胞的酶活可達(dá)29U/mL，在反應(yīng)3個批次后，酶活約為27U/mL，反應(yīng)4個批次后，酶活仍能維持21 U/mL左右。李秋喜等[89]通過海藻酸鈉與戊二醛的包埋-交聯(lián)法固定化大腸桿菌，用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖。固定化細(xì)胞的酶活回收率為76% ，在循環(huán)使用8次后，酶活仍能保留60% 以上。在形成海藻酸鈣微球前加入硅藻土可以擴大微球內(nèi)孔道，得到催化活性更高的細(xì)胞。孫帆等[85]通過硅藻土-海藻酸鈉的吸附-包埋法固定重組枯草芽孢桿菌，用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖。固定化細(xì)胞酶活回收率為64% ，連續(xù)反應(yīng)7個批次后轉(zhuǎn)化率為28% ，酶活仍能保留81% 。在海藻酸鈉溶液中加入二氧化鈦可減少固定化細(xì)胞中的細(xì)胞泄露，增大了機械強度。但其使用注射器將混合液緩慢滴入氯化鈣中的方式比較繁瑣，且顆粒之間由于滴入時間的不同，導(dǎo)致顆粒的硬化時間存在較大誤差。魏玉霞等[86]通過海藻酸鈉-二氧化鈦固定重組枯草芽孢桿菌，用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖。固定化細(xì)胞的酶活回收率為82% ，在循環(huán)使用10次后，酶活回收率仍保留58% 。

殼聚糖與戊二醛的吸附-交聯(lián)法是另一種簡單有效的細(xì)胞固定方法。Hirose等[52]在白蛋白存在下通過殼聚糖與戊二醛固定放射土壤桿菌細(xì)胞，用于生產(chǎn)D-甘露糖。固定化酶的轉(zhuǎn)化率在20% ～23% ，半衰期約為60 d。反應(yīng)14 d后，180 mL流出液中積累多達(dá)9 g的D-甘露糖。

4 結(jié)論與展望

固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)的運用將成為功能糖生物制造未來的發(fā)展趨勢，天然高分子、合成高分子和納米材料已被開發(fā)用于固定化酶/固定化細(xì)胞合成功能糖。目前，大部分研究的重點在于功能糖合成路徑的構(gòu)建，如高表達(dá)菌株的構(gòu)建以及多基因的共表達(dá)菌株的構(gòu)建。用于功能糖生物制造的固定化酶和固定化細(xì)胞研究較少，還需要在以下幾個方面做出努力：（1）引入高性能、低成本的固定化新材料，在一定程度上維持固定化酶/固定化細(xì)胞的酶活，延長固定化酶/固定化細(xì)胞的使用壽命，進(jìn)而大大降低功能糖的生產(chǎn)成本；（2）消除功能糖合成過程中可能產(chǎn)生的副反應(yīng)，如美拉德反應(yīng)，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量；（3）構(gòu)建適于固定化技術(shù)的反應(yīng)器，如填充床反應(yīng)器，通過批次反應(yīng)、放大試驗，實現(xiàn)功能糖連續(xù)、穩(wěn)定、規(guī)?；铣?，促進(jìn)綠色生物制造產(chǎn)業(yè)發(fā)展。