D-塔格糖的生理活性及生物合成研究進(jìn)展

李子杰, 沈立群, 費(fèi)康清, 陳 洲, 中西秀樹

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無錫 214122)

糖的過量攝入和肥胖0、糖尿病等慢性疾病具有相關(guān)性,糖過量對(duì)身體的危害不亞于酒精[1]。歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū),為了引導(dǎo)消費(fèi)者減少對(duì)糖的攝入,對(duì)含糖飲料等食品征收糖稅。近年來,減糖和代糖市場(chǎng)需求持續(xù)火熱;控糖、減糖契合“健康中國”這一國家重要戰(zhàn)略需求。稀有糖是自然界中存在但含量很低的單糖及其衍生物[2],作為一類新型的功能性甜味劑,已成為國際上研究的熱點(diǎn)。稀有糖食用后產(chǎn)生能量較少且具有抑制血糖升高、抗肥胖、抗氧化、抗炎等生理功能[3-4],以極低卡路里的稀有糖作為代糖符合“大衛(wèi)生、大健康”這一理念[5-6]。D-塔格糖作為一種稀有糖,其口感與蔗糖相近,甜度是蔗糖的92%,但熱量卻只有蔗糖的三分之一。D-塔格糖具有多種有益于人體的生理功能,如預(yù)防肥胖、降低血糖、抗齲齒、抗氧化、益生、改善腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防心腦血管疾病等,因此D-塔格糖是一種理想的功能性甜味劑。2001年,美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)將D-塔格糖認(rèn)定為“公認(rèn)安全”(generally recognized as safe,GRAS)食品[7],并被世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑委員會(huì)(The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦作為一種新型甜味劑,可以作為食品添加劑使用[8]。2014年,依據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新食品原料安全性審查管理辦法》,國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)D-塔格糖為食品新原料。因此,D-塔格糖有著非常廣闊的市場(chǎng)前景。

1 D-塔格糖的代謝及生理活性

D-塔格糖是一種重要的稀有己酮糖,是D-半乳糖的同分異構(gòu)體、D-果糖的C-4 差向異構(gòu)體或D-山梨糖的C-3差向異構(gòu)體,結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 D-塔格糖的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of D-tagatose

1.1 D-塔格糖的代謝

D-塔格糖在人體內(nèi)的代謝過程見圖2。

圖2 D-塔格糖的代謝過程Fig.2 Metabolic process of D-tagatose

雖然D-塔格糖與D-果糖在結(jié)構(gòu)上具有相似性,人體對(duì)D-塔格糖的吸收效率很低,僅有20%～25%被小腸吸收。D-塔格糖被小腸吸收后,代謝過程和D-果糖類似,但代謝速率只有果糖的50%。在果糖激酶的作用下,D-塔格糖被轉(zhuǎn)化為D-塔格糖-1-磷酸,后者在醛縮酶的作用下分解為磷酸二羥丙酮和甘油醛。相對(duì)于D-果糖,果糖激酶對(duì)D-塔格糖顯示了較低的親和作用[9]。沒有被小腸吸收的D-塔格糖進(jìn)入大腸,被腸道微生物發(fā)酵并產(chǎn)生短鏈脂肪酸[10-11]。在大腸中,D-塔格糖通過半乳糖的分支代謝途徑——塔格糖-6-磷酸代謝通路進(jìn)行代謝。在己糖激酶的作用下,D-塔格糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖-6-磷酸,進(jìn)而在塔格糖-6-磷酸激酶和塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶的作用下,分解為磷酸二羥丙酮和甘油醛-3-磷酸。

1.2 D-塔格糖的生理活性

D-塔格糖具有降血糖、減少肥胖、益生、抗齲齒、抗氧化、提高生育能力等多種生理功能(圖3)。

圖3 D-塔格糖的主要生理活性Fig.3 Main physiological activity of D-tagatose

1.2.1降低血糖

D-塔格糖能夠調(diào)控健康人群和Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平。與傳統(tǒng)口服的治療糖尿病藥物相比,D-塔格糖安全性高、具有抗氧化活性以及抑制體重增加等優(yōu)點(diǎn)[11]。研究表明:糖尿病患者在進(jìn)行葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)前30 min給予75 g D-塔格糖,能夠顯著抑制血糖升高且不會(huì)影響血液中的胰島素水平[12],并且D-塔格糖的最小劑量為5 g(3次/d)能夠有效控制Ⅱ型糖尿病患者的乙?；t蛋白水平[13]。到目前為止,D-塔格糖的降血糖機(jī)理還沒有完全闡明,其可能的機(jī)理如下:D-塔格糖在肝臟中的代謝同D-果糖類似,在果糖激酶的作用下生成D-塔格糖-1-磷酸,后者能夠誘導(dǎo)葡萄糖激酶從細(xì)胞核進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì),增強(qiáng)葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入糖酵解途徑,同時(shí)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原[14-15]。D-塔格糖-1-磷酸還能夠抑制糖原磷酸化酶的活性,從而抑制糖原分解為葡萄糖。此外D-塔格糖能夠抑制腸道中主要的消化酶類(蔗糖酶和麥芽糖酶)的活性,實(shí)現(xiàn)降低血糖的作用。因此,D-塔格糖可以作為代糖添加到糖尿病患者的飲食中,實(shí)現(xiàn)輔助降低血糖的功效。

1.2.2減少肥胖

體重管理對(duì)于減少肥胖相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)起著重要的作用。D-塔格糖具有低熱量的特性,能夠作為一種有前景的用于體重管理的甜味劑。對(duì)于很多糖尿病患者,降低體重是控制血糖的關(guān)鍵因素。糖尿病患者長期服用D-塔格糖能夠明顯降低體重[16],并且D-塔格糖能夠減少健康男性的食物攝入量[17]。對(duì)于孕婦而言,比較常見的問題是體重管理,如果體重過度增加,將會(huì)增加母親和胎兒的健康風(fēng)險(xiǎn),因此D-塔格糖在母嬰市場(chǎng)也有著潛在的應(yīng)用前景。

1.2.3益生功能

益生元是指一些不被宿主消化吸收卻能夠選擇性地促進(jìn)體內(nèi)有益菌的代謝和增殖,從而改善宿主健康的有機(jī)物質(zhì)[18]。D-塔格糖就是一種很好的益生元,D-塔格糖對(duì)人體的腸胃條件有抗性,能有效地刺激益生菌的生長,特別是Bifidobacteriuminfantis,從而抑制致病菌的生長[19];研究表明,人體健康的口腔中富含D-塔格糖,并且因?yàn)镈-塔格糖對(duì)Streptoccusgordonii等導(dǎo)致齲齒的細(xì)菌生長有著抑制作用[20],所以具有抗齲齒功能。促進(jìn)益生菌的增殖、抑制致病菌的生長、抗齲齒等功能都體現(xiàn)了D-塔格糖良好的益生功能。

1.2.4抗氧化

細(xì)胞內(nèi)的自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷,從而導(dǎo)致癌癥、衰老或其他疾病。D-塔格糖具有減弱胞內(nèi)自由基造成細(xì)胞損傷的潛能。研究表明:與等物質(zhì)量的葡萄糖、甘露醇或木糖相比,D-塔格糖能夠抑制藥物呋喃咀啶所造成的小鼠肝細(xì)胞的氧化損傷[21]。D-塔格糖具有弱鐵螯合的特性。因此,可以通過抑制由鐵催化的膜脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)羰基形成所導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生,保護(hù)細(xì)胞免受鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[22-23]。

1.2.5其他功能

D-塔格糖還在器官移植、提高生育能力、新生兒的成長等方面發(fā)揮作用[22],并且科研人員對(duì)于其生理功能的研究也從未停止,D-塔格糖的應(yīng)用潛力還有很大。

2 D-塔格糖的生物合成方法

D-塔格糖的合成方法主要有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成法是以D-半乳糖為原料,在堿性或堿土金屬的催化下,發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng),生成金屬氫氧化物和D-塔格糖復(fù)合物中間體沉淀,然后用酸中和中間體,得到D-塔格糖?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)D-塔格糖雖然是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法,但是在生產(chǎn)過程中需要高溫高壓的條件,并且容易生成山梨糖、甘露糖等雜糖,不利于分離純化。因此,為了克服這些缺點(diǎn),生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-塔格糖得到了廣泛的關(guān)注和研究[24-25]。經(jīng)過多年的深入研究,生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-塔格糖按照底物的不同可分為3大類,分別以己糖、乳糖和多糖為底物。

2.1 以己糖為原料

市場(chǎng)上可獲得的稀有糖非常有限且價(jià)格昂貴,這嚴(yán)重限制它們的開發(fā)和應(yīng)用。為了克服這種狀況,有必要尋找能夠大規(guī)模生產(chǎn)稀有糖的方法。Izumori 提出Izumoring策略為稀有糖的生產(chǎn)提供了解決方法[26]。以己糖為原料生產(chǎn)D-塔格糖主要涉及了3種酶,即異構(gòu)酶、差向異構(gòu)酶和脫氫酶。異構(gòu)酶主要用于催化D-半乳糖,差向異構(gòu)酶用于催化D-果糖和D-山梨糖,脫氫酶用于催化半乳糖醇(圖4)。

圖4 以己糖為底物合成D-塔格糖Fig.4 Synthesis of D-tagatose with hexoses as substrates

2.1.1以半乳糖醇為原料

以半乳糖醇為原料生產(chǎn)D-塔格糖是研究最早的一種生物合成方法,主要是利用山梨醇脫氫酶脫氫氧化半乳糖醇生成D-塔格糖。早期對(duì)D-塔格糖生產(chǎn)的研究主要采用微生物Arthrobacterglobiformis和Mycobacteriumsmegmatis將半乳糖醇氧化為D-塔格糖[27]。目前的研究主要利用氧化葡萄糖酸桿菌表達(dá)膜結(jié)合的山梨醇脫氫酶將半乳糖醇氧化成D-塔格糖和L-木糖-3-己酮糖[28]。由于半乳糖醇價(jià)格比較昂貴,生產(chǎn)成本高,導(dǎo)致D-塔格糖的商業(yè)價(jià)格較高,限制了D-塔格糖的應(yīng)用。

2.1.2以D-半乳糖為原料

由于D-半乳糖比半乳糖醇價(jià)格相對(duì)便宜,商業(yè)應(yīng)用潛力較高。以D-半乳糖為原料,酶催化合成D-塔格糖逐漸成為主流合成方法[29]。該方法用到的核心酶是L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase,AI),由于D-半乳糖和 L-阿拉伯糖結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,因此AI 能夠催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖[30]。為了提高D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的產(chǎn)率,對(duì)該酶類進(jìn)行了諸多研究。比如對(duì)多種來源的AI進(jìn)行分子改造以提高酶活、催化效率、pH值和溫度穩(wěn)定性等,或通過酶固定化技術(shù)提高D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的效率[24, 31]。目前,這些研究已經(jīng)逐漸達(dá)到飽和,現(xiàn)主要集中在尋找可以提升D-塔格糖產(chǎn)量的催化方法,如采用固定在海藻酸鹽載體上的AI小球的填充床反應(yīng)器生產(chǎn)D-塔格糖,使反應(yīng)的平衡轉(zhuǎn)化率達(dá)到了50%,并且可以多次循環(huán)使用[32]。

2.1.3以D-果糖為原料

近年來,生物法合成D-塔格糖普遍采用以D-半乳糖為底物,通過AI進(jìn)行催化合成。然而D-半乳糖與葡萄糖、果糖、淀粉等碳水化合物相比,生產(chǎn)成本還是較為昂貴,不利于D-塔格糖大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用,因此尋找能夠利用廉價(jià)易得的生物質(zhì)資源實(shí)現(xiàn)D-塔格糖高效合成的方法具有重要的研究意義。D-果糖是一種價(jià)格低廉且來源穩(wěn)定的單糖,是生產(chǎn)D-塔格糖的理想底物,但截至目前,還沒有在自然界發(fā)現(xiàn)天然存在的能催化D-果糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的相關(guān)酶類。2012年,Rodionova等[33]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的酶家族(命名為“UxaE”),能夠催化D-塔格糖醛酸轉(zhuǎn)化為D-果糖醛酸;Shin等[34]認(rèn)為該酶可能對(duì)D-果糖具有4-異構(gòu)化活性,因?yàn)槠涞孜锖凸怯兄嗨频慕Y(jié)構(gòu),進(jìn)而通過合理的設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化,提高了該酶對(duì)D-果糖的C4-差向異構(gòu)化活性,并將該突變酶命名為D-塔格糖4-差向異構(gòu)酶。將開發(fā)的D-塔格糖4-差向異構(gòu)酶應(yīng)用于D-塔格糖的合成,在最優(yōu)反應(yīng)條件下,700 g/L D-果糖在2 h內(nèi)轉(zhuǎn)化生成了213 g/L的D-塔格糖,轉(zhuǎn)化率為30%。

除了利用D-塔格糖4-差向異構(gòu)酶催化果糖生產(chǎn)D-塔格糖外,還有2種以D-果糖為底物生產(chǎn)D-塔格糖的多酶催化途徑(圖5):1)D-果糖在己糖激酶的作用下生成D-果糖-6-磷酸,D-果糖-1,6-二磷酸醛縮酶催化D-果糖-6-磷酸生成D-塔格糖-6-磷酸,最后D-塔格糖-6-磷酸在磷酸酶的作用下生成D-塔格糖[35]。由于這種方法需要激酶參與,反應(yīng)過程中需要加入ATP,不利于實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用,因此該方法研究比較少[36];2)Yoshihara等[37]成功用米根霉RhizopusoryzaeMYA-2483催化D-阿洛酮糖生成了D-塔格糖,并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的Mucoraceae真菌都具有這種轉(zhuǎn)化能力,因此可以用D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶將D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖[38],然后再將D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖。利用D-果糖大規(guī)模生產(chǎn)D-阿洛酮糖是可行的,因此這種方法有可能應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn),但相關(guān)的研究并不多。

圖5 以D-果糖為底物多酶催化合成D-塔格糖Fig.5 Synthesis of D-tagatose by multienzyme catalysis with D-fructose as substrate

2.2 以乳糖為原料

以乳糖為原料生產(chǎn)D-塔格糖,通過β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖異構(gòu)酶雙酶催化完成,這也是近年來的研究熱點(diǎn)。乳清通常是乳制品生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的富含乳糖的副產(chǎn)品,在過去常被當(dāng)作廢棄物。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,現(xiàn)已成為有價(jià)值的食品原料,可用于D-塔格糖的生產(chǎn)。以乳糖為底物,在過量表達(dá)β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖異構(gòu)酶的全細(xì)胞催化下,可以得到不同產(chǎn)物濃度的D-塔格糖(12.7～96.8 g/L),從乳糖到D-塔格糖的產(chǎn)率范圍在19.4%～36.7%(表1[39-47])。因此這種方法對(duì)碳源的利用率并不高,并且殘留物會(huì)對(duì)D-塔格糖的分離純化造成困難。為了解決這個(gè)問題,可以乳糖為原料同時(shí)生產(chǎn)多個(gè)產(chǎn)品,比如以乳清粉為原料,同時(shí)生產(chǎn)D-塔格糖和生物乙醇,產(chǎn)率分別達(dá)到23.5%和26.9%[48],這樣不但能夠提高對(duì)碳源的利用率,還能生產(chǎn)出有價(jià)值的副產(chǎn)品。由于乳清粉中含有其他不明確的成分,可能會(huì)影響阿拉伯糖異構(gòu)酶的活性,導(dǎo)致其產(chǎn)率與乳糖相比下降了7.8%。

表1 以乳糖和多糖為底物生產(chǎn)D-塔格糖

2.3 以多糖為原料

生產(chǎn)D-塔格糖的多糖主要有麥芽糊精和淀粉2種,是利用磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、C4差向異構(gòu)酶、磷酸酶轉(zhuǎn)化為D-塔格糖[49-50]。淀粉或麥芽糊精為底物多酶催化合成D-塔格糖的路徑見圖6。相較于以果糖為底物的多酶催化途徑,用于催化麥芽糊精和淀粉生成葡萄糖-1-磷酸的磷酸化酶不需要ATP的參與,降低了D-塔格糖的生產(chǎn)成本以及生產(chǎn)過程中的不穩(wěn)定性。為了避免純化多種合成酶類,Dai等[49]在大腸桿菌中構(gòu)建D-塔格糖合成代謝途徑,實(shí)現(xiàn)了從10 g/L麥芽糊精生成了3.38 g/L的D-塔格糖。Han等[50]構(gòu)建半人工細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)了從150 g/L麥芽糊精生成了72.2 g/L 的D-塔格糖,產(chǎn)率高達(dá)48.1%,具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

3 總結(jié)與展望

D-塔格糖作為一種理想的功能性甜味劑,具有廣闊的應(yīng)用前景。在減糖、代糖市場(chǎng)需求持續(xù)火熱的背景下,D-塔格糖對(duì)于滿足人民“減糖不減甜”的訴求,提高人民的生活質(zhì)量和健康水平具有重要意義。本文對(duì)近年來關(guān)于D-塔格糖的生理功能和生物法合成的研究進(jìn)行了綜述。為了降低D-塔格糖的生產(chǎn)成本,使其能走向千家萬戶,建議重點(diǎn)開展如下研究:1)以D-半乳糖為原料生產(chǎn)D-塔格糖的研究與商業(yè)化生產(chǎn)比較成熟,但成本較高的D-半乳糖限制了D-塔格糖的推廣應(yīng)用,可集中研究以果糖、乳糖、麥芽糊精和淀粉等廉價(jià)底物生產(chǎn)D-塔格糖,以擴(kuò)大D-塔格糖的市場(chǎng)規(guī)模;2)通過基于蛋白結(jié)構(gòu)的分子模擬,對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行(半)理性改造,提升關(guān)鍵酶的催化效率和穩(wěn)定性,提升其工業(yè)應(yīng)用潛能;3)構(gòu)建食品級(jí)的底盤細(xì)胞,并對(duì)底盤細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)性的改造,開發(fā)耐受高底物濃度、具有高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強(qiáng)度D-塔格糖的合成方法以及高效的D-塔格糖純化工藝;4)深入研究和不斷拓展D-塔格糖的功能,使其能充分體現(xiàn)出自己的優(yōu)勢(shì),在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品等領(lǐng)域中得到更加充分的應(yīng)用。開展上述研究有助于D-塔格糖的產(chǎn)業(yè)化,希望本文可以為D-塔格糖的推廣應(yīng)用提供有效的信息。