不同脫脂方法對(duì)高脂肪型復(fù)雜食物基質(zhì)中牛乳過敏原檢測(cè)的影響

胡 巍, 楊 帆, 熊子奕, 高金燕, 陳紅兵, 李 欣,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330047;2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院, 江西 南昌 330047;3.江西省食物過敏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330047;4.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院, 江西 南昌 330047)

牛乳是八大類過敏食物之一,其營(yíng)養(yǎng)豐富[1]。牛乳中含有30多種潛在的過敏原蛋白,其中酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是牛乳中的主要過敏原[2]。盡管過敏原標(biāo)簽的使用有效地提高了消費(fèi)者獲取過敏原信息的便利性,但是現(xiàn)行的標(biāo)簽法規(guī)仍不能消除食品中隱藏的過敏原所引起的潛在危險(xiǎn)。因此,實(shí)現(xiàn)食物過敏原的準(zhǔn)確檢測(cè)是保障食用安全的重要前提。

食物樣品的前處理方法是過敏原檢測(cè)的重要環(huán)節(jié),采用不同方法直接影響到檢測(cè)的準(zhǔn)確性,并與過敏原的豐度、含量和免疫反應(yīng)性有關(guān)[3]。食物基質(zhì)成分易于與過敏原形成共價(jià)鍵、離子鍵、氫鍵或疏水相互作用從而影響其檢測(cè)結(jié)果[4]。巧克力是相對(duì)復(fù)雜的食品基質(zhì)之一,原料乳粉中包含的乳蛋白是其主要的過敏物質(zhì),其中含有的大量脂肪可能會(huì)在調(diào)溫期間影響產(chǎn)品的結(jié)晶從而掩蔽部分過敏原表位[5]。此外,樣品制備過程中脂肪的存在會(huì)阻礙過敏原蛋白的分離提取或影響抗原抗體反應(yīng)從而降低檢測(cè)的準(zhǔn)確度[6]。因此,開發(fā)適用于高脂肪型食物脫脂的前處理方法迫在眉睫。然而直至目前,這類研究仍鮮有報(bào)道。

化學(xué)溶劑法和脂肪酶法作為食物中常見的脫脂方法,被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理中[7-8]。溶劑法常使用烷烴、醇和酯類等有機(jī)試劑溶解并分離脂肪[9],脂肪酶法通過使酯鍵水解斷裂,將脂肪轉(zhuǎn)化成較易從蛋白質(zhì)中分離出來的脂肪酸和甘油[10]。然而,溶劑和酶均可能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),導(dǎo)致過敏原的致敏性發(fā)生變化。崔巖巖等[11]使用溶劑法對(duì)椰子粕進(jìn)行脫脂處理,發(fā)現(xiàn)脫脂溶劑破壞了椰子分離蛋白亞基的二硫鍵,同時(shí)通過破壞蛋白分子間的疏水鍵使其三級(jí)結(jié)構(gòu)展開。耿勤[12]發(fā)現(xiàn)脂肪酶脫脂會(huì)改變米渣蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)并使其溶解性降低。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響著過敏原的致敏性,結(jié)構(gòu)變化的過程中其表位的含量和暴露情況也可能隨之變化。因此,脫脂效果好、過敏原提取率高且對(duì)過敏原結(jié)構(gòu)影響較小的脫脂方法是目前高脂肪型復(fù)雜食物基質(zhì)前處理的研發(fā)重點(diǎn)。

本研究選用含有牛乳過敏原的巧克力作為高脂肪型食物基質(zhì)模型,分別利用正己烷、異丙醇和乙酸乙酯等脫脂劑和脂肪酶對(duì)樣品進(jìn)行脫脂處理,比較了不同脫脂方法對(duì)樣品脫脂率、蛋白損失率、粒度、蛋白結(jié)構(gòu)、脂肪分布情況和微觀結(jié)構(gòu)的影響。此外,利用間接ELISA定量脫脂前后樣品中主要牛乳過敏原的濃度,依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3種牛乳過敏原分別確定一種較優(yōu)的脫脂方法,以期有效提升高脂肪型復(fù)雜食物基質(zhì)中牛乳過敏原的提取效果,最終達(dá)到提升檢測(cè)準(zhǔn)確度的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉,恒天然商貿(mào)上海有限公司(由純牛乳噴霧干燥獲得,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%);可可粉,太古糖業(yè)(中國(guó))有限公司;可可脂,法國(guó)可可百利公司;正己烷、異丙醇、乙酸乙酯均為色譜純,德國(guó)Meker公司;食品脂肪酶(活力值50 000 U),安徽綠微康生物科技有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、預(yù)染大分子蛋白質(zhì)Marker、考馬斯亮藍(lán)R250、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt, ANS)、羊抗兔lgG抗體,美國(guó)Sigma公司;尼羅紅染色劑,北京索萊寶科技有限公司;3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB),欣博盛生物科技有限公司;兔抗α-乳白蛋白、兔抗β-乳球蛋白和兔抗酪蛋白血清為實(shí)驗(yàn)室自制。其他常用生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SZC-101S1型脂肪測(cè)定儀,上海纖檢儀器有限公司;XCell4 SureLock 中型膠電泳槽,美國(guó)Bio-RAD公司;TU-1901型紫外分光光度計(jì),北京普析通用儀器公司;F-4600型熒光分光光度計(jì)、Regulus 8100型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡,日本Hitachi公司;Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;BI-200SM型動(dòng)靜態(tài)光散射儀,美國(guó)Brookhaven公司;Leica TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡,德國(guó)Laica公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模擬高脂肪型復(fù)雜食物基質(zhì)的制備

巧克力食品模型較多,為了保障配方的穩(wěn)定性,參考文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)模型并進(jìn)行調(diào)整得出最終模型[13],乳粉60 g,可可脂70 g,白砂糖20 g。原材料混合均勻后在60 ℃下融化并攪拌,于45 ℃精煉 1 h, 隨后在27～29 ℃進(jìn)行調(diào)溫,放入冰箱4 ℃冷卻凝固2 h。

1.3.2脫脂處理方法

1)溶劑法。將樣品和脫脂劑加入離心管中,恒溫37 ℃磁力攪拌2 h,獲得的處理液在8 000g下離心10 min,棄去上清,于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥并揮發(fā)溶劑,收集粉末狀樣品備用。

2)酶法。向磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)中加入脂肪酶以獲得質(zhì)量濃度為0.3 g/L的脫脂酶液,樣品預(yù)熱后加入酶液進(jìn)行水解,于 50 ℃下攪拌90 min。之后采用95 ℃水浴加熱處理10 min使酶滅活,于冷水浴中迅速冷卻,凍干成粉末狀。

1.3.3脫脂率的測(cè)定

參考羅舜菁等[14]的方法并稍加修改。稱取2 g左右樣品,轉(zhuǎn)入在底部已塞脫脂棉的濾紙筒內(nèi),再用脫脂棉塞入上部壓住試樣,放入專用鋁杯中,于脂肪測(cè)定儀中進(jìn)行脂肪量的測(cè)定。

設(shè)置浸泡、抽提、回收、烘干4個(gè)階段的溫度和時(shí)間,55 ℃浸泡1.5 h,75 ℃抽提1.5 h,85 ℃溶劑回收15 min,烘干階段設(shè)為110 ℃45 min。稱量測(cè)定前后鋁杯的質(zhì)量差以獲得脂肪質(zhì)量,脫脂率的計(jì)算見式(1)。

(1)

式(1)中,w0為脫脂前樣品脂肪體積分?jǐn)?shù),g/100g;w1為脫脂后樣品脂肪體積分?jǐn)?shù),g/100g。

1.3.4蛋白損失率的測(cè)定

采用Bradford(考馬斯亮藍(lán))法測(cè)定脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的損失率。本研究將BSA設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。向96孔酶標(biāo)板中每孔加入20 μL待測(cè)樣品和200 μL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液混勻,避光放置10 min,于595 nm處測(cè)定其吸光度值,繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計(jì)算出樣液的蛋白質(zhì)濃度,蛋白損失率的計(jì)算見式(2)。

(2)

式(2)中,ρ0為脫脂處理前蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;ρ1為脫脂處理后蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.3.5蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)對(duì)脫脂處理后模擬基質(zhì)中的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定分析。每孔上樣8 μL。電泳條件設(shè)置為:電流12 mA(濃縮膠)和24 mA(分離膠)?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色15 min,染色結(jié)束用冰醋酸-甲醇溶液進(jìn)行脫色。

1.3.6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1.3.6.1 圓二色譜分析

參考操?gòu)?qiáng)等[15]的研究方法采用圓二色譜儀測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。比色皿厚度為1 mm,波長(zhǎng)范圍為190～240 nm,速度為100 nm/min,在室溫及連續(xù)吹入氮?dú)鈼l件下檢測(cè),樣品掃描3次取其平均值,通過差減除去空白基線信號(hào)值,再使用Dichroweb網(wǎng)站計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.6.2 內(nèi)源性熒光光譜分析

參考Gao等[16]的研究方法采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。設(shè)定熒光分光光度計(jì)的條件為:激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)(λem)為300～450 nm,光步5 nm,測(cè)試時(shí)間為200 ms,狹縫寬度為5.0 nm,對(duì)樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描。

1.3.6.3 三維熒光分析

采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)(λex)范圍為200～400 nm,發(fā)射波長(zhǎng)(λem)范圍為200～600 nm時(shí),兩者都以5 nm為間距增加,采集熒光信號(hào)得到激發(fā)發(fā)射矩陣熒光光譜,即三維熒光光譜。

1.3.7蛋白質(zhì)表面疏水性的測(cè)定

本研究以ANS熒光探針法測(cè)定蛋白質(zhì)的表面疏水性差異[17]。室溫下以1∶50的比例向樣品中加入5 mmol/L ANS溶液,避光反應(yīng)1 h后使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)(λem)為400～600 nm,掃描速度為1 200 nm/min,狹縫寬度為5.0 nm。

1.3.8脂肪分布的測(cè)定

使用激光共聚焦顯微鏡觀察測(cè)定模擬基質(zhì)的脂肪分布,參考謝安琪等[18]的方法并稍加修改。取1 mL樣品加入20 μL質(zhì)量濃度為0.01 g/L的尼羅紅染料并混合均勻,避光放置30 min。將樣品均勻涂布于載玻片上并固定在激光共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上,20倍物鏡,設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,并采集熒光圖像。

1.3.9模擬基質(zhì)粒度的測(cè)定

參考Xie等[19]的研究方法,采用動(dòng)靜態(tài)光散射表征模擬基質(zhì)的平均粒徑大小并比較粒徑分布的情況。

1.3.10模擬基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考步營(yíng)等[20]的方法測(cè)定模擬基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)。蘸取少量脫脂前后的樣品粉末均勻涂布于導(dǎo)電膠上,并將導(dǎo)電膠貼合在置物臺(tái)上,將附有樣品的置物臺(tái)放在冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下進(jìn)行觀察,電壓設(shè)置為5 kV。

1.3.11牛乳過敏原質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考本團(tuán)隊(duì)先前建立的間接ELISA方法[21]并稍加修改,測(cè)定模擬基質(zhì)中牛乳過敏原的濃度。分別以α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白和稀釋一定倍數(shù)的待測(cè)樣品作為包被抗原,兔多克隆抗體作為一抗,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗。α-乳白蛋白:將α-乳白蛋白用PBS梯度稀釋至0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 μg/mL進(jìn)行抗原包被,兔抗α-乳白蛋白血清稀釋倍數(shù)為1∶160 000,繪制α-乳白蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-乳球蛋白:將β-乳球蛋白用PBS梯度稀釋至0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5 μg/mL進(jìn)行抗原包被,兔抗β-乳球蛋白血清稀釋倍數(shù)為 1∶160 000。酪蛋白:將酪蛋白用PBS梯度稀釋至0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL進(jìn)行抗原包被,兔抗酪蛋白血清稀釋倍數(shù)為1∶10 000。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值,采用SPSS 24.0進(jìn)行差異顯著性分析,認(rèn)為P<0.05時(shí)為具有顯著性差異,采用Origin 9.0進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂方法對(duì)模擬基質(zhì)脫脂率和蛋白損失率的影響

不同脫脂方法處理后樣品的脫脂率和蛋白損失率見圖1。由圖1可知,4種脫脂方法的脫脂率由優(yōu)到差依次為正己烷、乙酸乙酯、脂肪酶、異丙醇。正己烷和乙酸乙酯的脫脂率均超過80%,其中正己烷脫脂率高達(dá)87.87%。此外,脫脂處理后模擬基質(zhì)中的蛋白質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的損失,其中正己烷對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響最小,損失率為6.86%,異丙醇影響最大,損失率超過30%。

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品,不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖1 脫脂方法處理后模擬基質(zhì)的脫脂率和蛋白損失率Fig.1 Degreasing rate and protein loss rate of simulated matrix treated with different degreasing methods

2.2 脫脂方法對(duì)模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的影響

不同脫脂方法處理后模擬基質(zhì)中乳蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知,樣品主要存在4條蛋白條帶,分子質(zhì)量依次位于35、25、15、10 kDa左右。這與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致,巧克力中只含有乳蛋白,在25～35 kDa的是牛乳中含量最高的酪蛋白,分別位于15 kDa和10 kDa上方的是分子質(zhì)量為18.3 kDa的β-乳球蛋白和14.2 kDa的α-乳白蛋白。脫脂前后樣品中蛋白的組分和分子質(zhì)量大小無顯著變化,表明4種脫脂處理方法對(duì)樣品中主要的牛乳過敏原蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生影響。

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。泳道M:蛋白 Marker;泳道1:對(duì)照組;泳道2～5 :正己烷組、異丙醇組、乙酸乙酯組和脂肪酶組。Casein:酪蛋白;ALA:α-乳白蛋白;BLG:β-乳球蛋白。圖2 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.3 脫脂方法對(duì)模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1圓二色譜分析結(jié)果

圓二色性光譜廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象研究領(lǐng)域。對(duì)不同脫脂方法處理前后蛋白質(zhì)的圓二色性光譜進(jìn)行分析,結(jié)果見圖3和表1。由圖3和表1可知,在190～240 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi),190 nm處的正峰和208、220 nm處的負(fù)峰是α-螺旋的特征峰,而195 nm左右的正峰和217 nm左右的負(fù)峰是β-折疊的特征峰。整體來看,脫脂處理改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。和對(duì)照組相比,溶劑法脫脂處理后樣品蛋白的α-螺旋含量均降低,正己烷、異丙醇和乙酸乙酯組分別降低了56.8%、88.1%和34.7%。異丙醇組β-轉(zhuǎn)角含量降低41.8%,β-折疊和無規(guī)則卷曲含量分別升高了2.4和1.5倍。研究發(fā)現(xiàn),氫鍵與二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化密切相關(guān)[22],脫脂溶劑中大多含有羥基、酯鍵、大量的氧原子和氫原子,可能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用從而改變了二級(jí)結(jié)構(gòu)中氫鍵的順序和排列模式,出現(xiàn)了大量反平行β-折疊聚集體[23]。此外,正己烷組β-轉(zhuǎn)角含量升高了1.6倍,β-折疊含量降低了31.6%,無規(guī)則卷曲含量降低了92.5%?？赡苁且?yàn)棣?螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,脯氨酸更加暴露于蛋白表面,促進(jìn)了β-轉(zhuǎn)角的形成[24]。乙酸乙酯組除α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角降低外,其他結(jié)構(gòu)含量均略微升高,但整體而言變化最小。脂肪酶處理后α-螺旋含量升高36%,β-轉(zhuǎn)角含量降低82.1%。這可能是由于脂肪酶處理后基質(zhì)中與蛋白質(zhì)結(jié)合的脂肪被去除,部分疏水區(qū)域暴露于蛋白質(zhì)表面,由于疏水相互作用而出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集。

表1 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖3 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的圓二色譜Fig.3 Circular dichroism spectrum of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.3.2內(nèi)源性熒光光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的3種熒光氨基酸成分為色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,色氨酸含量最多,酪氨酸的熒光通常會(huì)被淬滅,苯丙氨酸對(duì)蛋白質(zhì)固有熒光的貢獻(xiàn)由于其吸收率過低而通常忽略不計(jì)。因此,色氨酸通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜中340 nm處吸收峰的主要來源[25]。不同脫脂方法處理后蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光光譜結(jié)果見圖4。由圖4可知,3種溶劑脫脂后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度均有不同程度的增強(qiáng),而脂肪酶組的熒光強(qiáng)度略微降低。熒光增強(qiáng)可能是因?yàn)橹颈幻摮蟮鞍踪|(zhì)出現(xiàn)空穴結(jié)構(gòu),三級(jí)結(jié)構(gòu)更為松散,色氨酸微環(huán)境的極性降低。脂肪酶因?yàn)樘禺愋暂^強(qiáng),相對(duì)來說對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響最小,但熒光強(qiáng)度有略微降低,可能是因?yàn)樵谥久该撝?蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)先部分展開,但緊接著蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生新的疏水鍵,導(dǎo)致色氨酸和酪氨酸殘基被進(jìn)一步掩蔽。

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖4 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光光譜Fig.4 Intrinsic fluorescence spectrum of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.3.3三維熒光分析結(jié)果

不同脫脂方法處理后蛋白質(zhì)的三維熒光光譜及結(jié)果見圖5和表2。由圖5和表2可知,三維熒光光譜的結(jié)果與內(nèi)源性熒光光譜基本一致。樣品出現(xiàn)了2個(gè)明顯的蛋白熒光特征峰,峰a(λex=280 nm)和峰b(λex=235 nm)分別是由酪氨酸、色氨酸殘基的π→π*躍遷和多肽鏈骨架的n→π*躍遷引起的特征峰,此外,色氨酸的吲哚基團(tuán)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)中約280 nm處紫外吸收最主要的來源,它們可以表征蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[26]。結(jié)果表明:脫脂處理前后峰a位置無變化,峰b從原來的(λex=230 nm、λem=335 nm)紅移至(λex=235 nm、λem=335 nm或λex=235 nm、λem=340 nm)。溶劑法脫脂處理后模擬基質(zhì)中乳蛋白的三維熒光強(qiáng)度均升高,其中正己烷組對(duì)蛋白熒光強(qiáng)度影響最小,其次是乙酸乙酯。熒光增強(qiáng)可歸因于脫脂溶劑中的羥基自由基或氧自由基具有優(yōu)異的質(zhì)子親和能力,可能與芳香環(huán)中的氫質(zhì)子結(jié)合,促使更多吲哚基團(tuán)暴露[27]。相比于對(duì)照組,異丙醇組的峰a熒光強(qiáng)度升高了91.16%,同時(shí)峰b也升高了102.47%。異丙醇帶有羥基,易與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基作用[28],破壞原有的α-螺旋、β-折疊含量和分布情況,使得蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)整體呈現(xiàn)解折疊和展開的趨勢(shì),這與圓二色性光譜的結(jié)果一致。脂肪酶因?yàn)樘禺愋暂^強(qiáng),相對(duì)來說對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響較小,但熒光強(qiáng)度有略微降低,可能是因?yàn)樵谥久该撝?原脂肪與蛋白質(zhì)結(jié)合的位置形成了部分空穴結(jié)構(gòu),促使蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生一定的疏水相互作用而部分聚集。

表2 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的三維熒光光譜峰位置和峰強(qiáng)度

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖5 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的三維熒光光譜Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.4 脫脂方法對(duì)模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

ANS可與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水位點(diǎn)結(jié)合,因而測(cè)量蛋白質(zhì)的表面疏水性可采用此法[29]。不同脫脂方法處理后蛋白質(zhì)的ANS熒光光譜結(jié)果見圖6。由圖6可知,除脂肪酶組外,溶劑脫脂均使得蛋白的表面疏水性增強(qiáng)。其中,異丙醇組疏水性最強(qiáng),脂肪酶組最弱且低于對(duì)照組。通常來說,蛋白質(zhì)的帶電基團(tuán)和極性氨基酸殘基通常位于外部,而非極性部分主要位于蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)的內(nèi)部[30]。根據(jù)圓二色譜和內(nèi)源性熒光光譜的結(jié)果可知,溶劑脫脂處理使得模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的解折疊和展開,這可能使得原本包裹在內(nèi)部的疏水性空腔暴露于外部,從而為ANS提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)。研究表明,在高脂肪食品中脂肪與蛋白質(zhì)接觸緊密,脂肪在水解過程中產(chǎn)生的超氧化物自由基會(huì)促使蛋白質(zhì)也發(fā)生氧化,而蛋白質(zhì)氧化會(huì)引發(fā)氨基酸側(cè)鏈的碳化[31]。因此,脂肪酶的水解作用可能使得乳蛋白表面疏水性側(cè)鏈基團(tuán)改變,導(dǎo)致ANS結(jié)合位點(diǎn)減少。

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖6 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的ANS熒光光譜Fig.6 ANS fluorescence spectrum of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.5 脫脂方法對(duì)模擬基質(zhì)脂肪分布的影響

脂肪用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的尼羅紅染色,并將信號(hào)設(shè)置為綠色,可以清晰直觀地看到模擬基質(zhì)中綠色脂肪液滴的大小和分布情況。不同脫脂方法處理前后模擬基質(zhì)的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果見圖7。由圖7可知,未經(jīng)處理的對(duì)照組中存在大量脂肪,脂肪液滴直徑較大并呈現(xiàn)出大面積的聚集現(xiàn)象。經(jīng)過不同脫脂方法處理后,脂肪液滴表現(xiàn)出不同程度的減小,整體分布由大量聚集變得更為分散和均勻。其中正己烷組的液滴最小且數(shù)量最少,其次是乙酸乙酯和脂肪酶。與脫脂率的結(jié)果一致,異丙醇組雖然未見明顯的大脂肪塊,但液滴分布仍然較為密集,去除的脂肪在4種脫脂方法中最少。根據(jù)相似相溶原理,結(jié)構(gòu)相似的化合物更容易互相混溶,可能是因?yàn)楫惐嫉臉O性比正己烷和乙酸乙酯的更強(qiáng),脂肪在強(qiáng)極性環(huán)境中溶解性較差。相反,正己烷的極性最弱,更有利于脂肪的溶解和去除。

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖7 激光共聚焦顯微鏡下脫脂處理后的模擬基質(zhì)Fig.7 Laser confocal micrographs of simulated matrix after degreasing treatment

2.6 脫脂方法對(duì)模擬基質(zhì)粒度的影響

脫脂處理后模擬基質(zhì)的粒度測(cè)定結(jié)果見圖8。由圖8可知,從粒度分布情況來看,對(duì)照組顆粒大小均一且呈現(xiàn)單峰分布,正己烷組和乙酸乙酯組的變化較小,同樣呈現(xiàn)單峰分布。異丙醇組和脂肪酶組由單峰分布變?yōu)殡p峰分布,說明模擬基質(zhì)中產(chǎn)生了大顆粒聚集體。從平均粒徑來看,正己烷組和乙酸乙酯組的粒徑略微降低,這可能是因?yàn)槊撝幚砗笾痉肿訌牡鞍踪|(zhì)-脂肪復(fù)合物上脫去,溶液體系粒徑隨之降低。相反的是,異丙醇組粒徑顯著升高,由297.9 nm升高至445.1 nm,可能是因?yàn)楫惐硷@著改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),使其過度變性,形成了更大的聚集體。同時(shí),異丙醇組的脫脂率最低,體系內(nèi)殘留的脂肪易與蛋白質(zhì)的疏水側(cè)鏈重新結(jié)合形成新的復(fù)合物。

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品;圖8(a)至圖8(e)為不同脫脂方法處理后模擬基質(zhì)的粒徑大小分布情況,圖8(f)為平均粒徑大小;不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖8 脫脂處理后模擬基質(zhì)的粒度Fig.8 Particle size of simulated matrix after degreasing treatment

2.7 脫脂方法對(duì)模擬基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的影響

在放大倍數(shù)為5 000倍下使用掃描電鏡觀察不同方法脫脂前后模擬基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果見圖9。由圖9可知,脫脂處理后表面形貌發(fā)生了明顯的改變。由圖9(a)可知,未處理的模擬基質(zhì)表面光滑,內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊湊,視野內(nèi)可見大范圍的致密平滑結(jié)構(gòu),可能是因?yàn)榛|(zhì)中的脂肪與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,致使顆粒之間大量聚集黏附。由圖9(b)可知,正己烷脫脂處理后基質(zhì)呈現(xiàn)出了多孔疏松的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這是由于脂肪分子被脫去后基質(zhì)顆粒黏連情況明顯減少,蛋白質(zhì)由大量聚集轉(zhuǎn)變?yōu)榫环稚⒌臓顟B(tài),因而顯示出更為清晰的骨架。乙酸乙酯脫脂后基質(zhì)表面出現(xiàn)明顯的裂解,產(chǎn)生明顯的空腔,但其蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)不均一且仍存在少量結(jié)塊,這可能是因?yàn)橐宜嵋阴テ茐牧瞬糠值鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其整體骨架結(jié)構(gòu)不明顯[32]。脂肪酶脫脂后基質(zhì)表面雖然出現(xiàn)了少許直徑較大的孔洞,但仍可看出其余部分存在明顯的光滑平面和塊狀堆積。異丙醇組呈現(xiàn)出不規(guī)則大小的結(jié)塊,一方面是因?yàn)橹練埩糨^多,另一方面是因?yàn)楫惐紝?duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞最為顯著,蛋白質(zhì)之間發(fā)生了聚集現(xiàn)象,基質(zhì)重新形成平滑致密的結(jié)構(gòu)[14]。

2.8 脫脂方法對(duì)牛乳過敏原提取質(zhì)量濃度的影響

利用間接ELISA獲得模擬基質(zhì)中3種主要牛乳過敏原的質(zhì)量濃度,結(jié)果見圖10。由圖10可知,溶劑脫脂處理整體提高了模擬基質(zhì)中過敏原的提取質(zhì)量濃度。然而,在脂肪酶組中表現(xiàn)為降低的趨勢(shì),不利于過敏原的提取和定量檢測(cè)。牛乳中蛋白質(zhì)的含量為3.0%～3.5%,其中酪蛋白占80%,是牛乳中含量最高的過敏原。除脂肪酶之外,其他3種溶劑脫脂均提高了酪蛋白的提取率。其中,乙酸乙酯組的過敏原質(zhì)量濃度最高,由對(duì)照組的31.3 mg/mL升高至50.4 mg/mL,提升了61.02%。盡管該方法整體的蛋白損失率高于正己烷,但結(jié)果顯示其更適合于酪蛋白的提取。對(duì)于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,正己烷脫脂后兩者的質(zhì)量濃度最高,分別為0.73 mg/mL和1.89 mg/mL?？赡苁且?yàn)檎和榈拿撝Ч罴?消除了脂肪基質(zhì)對(duì)過敏原提取的阻礙作用。同時(shí),該方法下的蛋白質(zhì)損失量也最少,說明過敏原在該溶劑中的溶解度低,可以較好地保留下來。然而,異丙醇和乙酸乙酯處理后α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的濃度均有所降低,可能是因?yàn)樗鼈儗?duì)這兩種過敏原蛋白結(jié)構(gòu)影響較為顯著,從而使得表位更為隱蔽,甚至破壞了過敏原內(nèi)部表位[33]。

對(duì)照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品;不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖10 脫脂前后模擬基質(zhì)中主要牛乳過敏原的質(zhì)量濃度Fig.10 Main milk allergens concentration in simulated matrix after degreasing methods treatment

3 結(jié) 論

通過與過敏原發(fā)生相互作用,復(fù)雜食物基質(zhì)中的脂肪會(huì)影響過敏原的提取和抗原抗體反應(yīng)從而影響過敏原檢測(cè)結(jié)果。本研究首次提出通過脫脂處理提升高脂肪復(fù)雜食物基質(zhì)中牛乳過敏原檢測(cè)前處理效果的方法,利用正己烷、異丙醇、乙酸乙酯和脂肪酶對(duì)含有牛乳過敏原的高脂肪巧克力進(jìn)行脫脂處理,發(fā)現(xiàn)脂肪酶組效果不理想,而脫脂劑可以提高牛乳過敏原的溶出率。正己烷的脫脂率最高且蛋白損失率最低,分別為87.87%和6.86%。相比于未脫脂樣品,酪蛋白在乙酸乙酯組中的提取率最高并提升了61.02%,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在正己烷組中的提取質(zhì)量濃度最高,分別為0.73 mg/mL和1.89 mg/mL,并且正己烷和乙酸乙酯對(duì)過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)破壞較小,可以較好地維持過敏原的致敏性。為了進(jìn)一步優(yōu)化高脂肪型食物基質(zhì)中牛乳過敏原檢測(cè)的前處理方法,后續(xù)將對(duì)脫脂處理后過敏原的提取體系進(jìn)行研究。此外,還存在高淀粉和高蛋白等多個(gè)類型的復(fù)雜食物基質(zhì),未來應(yīng)針對(duì)不同類型的復(fù)雜食物基質(zhì)建立相應(yīng)的研究方案,為獲得更為完善的牛乳過敏原檢測(cè)前處理方法提供理論依據(jù)。