沙棘降解多糖結構表征和功能特性研究

孔志強, 趙玉紅,2,*

(1.東北林業(yè)大學 生命科學學院, 黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150040)

植物多糖具有抗衰老[1]、抗炎[2]、降血糖[3]、降血脂[4]和抗氧化[5]等生理功能,其生物活性受到其分子質量和結構特征 (單糖組成、異構碳構型、糖單元順序、聚合度和分支特性) 等影響[6-9]。研究表明,高分子質量多糖不容易穿透生物體的細胞膜屏障,從而導致生物學效應減弱[7, 10]。通過降解處理降低多糖分子質量,為提高其生物利用率提供了可行的方法[11]。

多糖降解方法有物理、化學和生物降解[9]。物理降解高效且環(huán)保,但需要專門的設備[12]。生物降解反應溫和,但需要基于復雜多糖結構對酶和微生物進行篩選[11]。化學降解包括酸降解、堿降解和H2O2降解[13]。H2O2降解因其條件溫和且綠色環(huán)保而被廣泛應用[14]。 H2O2主要是通過Fenton反應生成羥基活性自由基與氫原子,導致多糖解聚[15]。使用單一H2O2降解多糖通常不會導致分子質量顯著降低,必須激活H2O2以增加其解聚能力[16]。 Fe2+是一種還原劑,對H2O2促進多糖的降解有很強的催化能力[17]。與天然多糖相比,經H2O2聯(lián)合Fe2+(H2O2-Fe2+)降解得到的多糖具有更好的生物活性[11,18]。因此,基于 H2O2-Fe2+體系的Fenton降解是提高多糖生物活性的一種有效方法[8]。

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),胡頹子科沙棘屬,是廣泛種植于亞歐大陸的一種多刺落葉灌木植物[19],富含維生素、多酚、不飽和脂肪酸和多糖等多種生物活性物質[20]。沙棘多糖(sea buckthorn polysaccharides, SBP)具有降血糖[21]、抗氧化[22]和緩解肝損傷[10]等藥理活性,但其分子質量較高,水溶性較差,影響其生物活性的發(fā)揮與應用[23]。有研究證明高分子質量多糖經降解處理后其生物活性可顯著提高[24]。目前,有關沙棘多糖降解及其理化功能特性方面的研究鮮見報道。

本研究擬采用 H2O2-Fe2+法對SBP進行降解,研究沙棘降解多糖(sea buckthorn degraded polysaccharides, SBDP)的結構、功能特性及抗氧化活性,旨在為拓展SBPD在食品領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果渣,黑龍江省黑河市孫吳縣長樂山地大果沙棘開發(fā)有限公司,經粉碎、過篩(60目)、脫脂、干燥,得到沙棘果渣粉,備用。 DPPH、ABTS,上海遠業(yè)生物科技有限公司;單糖標準品和葡聚糖標準品(分子質量為5.000×103、1.160×104、2.380×104、4.860×104、8.090×104、1.480×105、2.730×105、4.098×105、6.678×105Da) ,揚州博睿糖生物科技有限公司;其他化學品均為分析純。

1.2 儀器與設備

EPOCH12型酶標儀,美國伯騰儀器有限公司;LC-10A型高效液相色譜儀,日本島津公司;RI-10A型示差檢測器,日本島津公司;ICS5000型離子色譜儀,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆賽默飛世爾科技公司;FD5-2.5E型冷凍干燥機,北京金西盟儀器有限公司;AR2000ex型動態(tài)旋轉流變儀,美國TA公司;FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀,天津港東科技發(fā)展股份有限公司;Zeta plus型激光粒度分析儀,美國布魯克海文儀器有限公司;AVANCE Ⅲ HD 500MHz型核磁共振波譜儀,瑞士布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1SBP的制備

參照裴晉紅等[25]的方法進行多糖提取。準確稱量沙棘果渣粉,按料液比1∶30(g/mL)[m(沙棘果渣粉)∶V(提取流)=1 g∶30 mL]加入蒸餾水,90 ℃ 提取2 h,4 000 r/min離心15 min,收集上清液,重復2次,合并提取液。提取液濃縮后用Sevage法除蛋白9次,醇沉靜置48 h,抽濾、取沉淀,分別用丙酮和無水乙醇洗2次,凍干后得到沙棘粗多糖。

1.3.2SBDP的制備

參照Zhang等[11]的方法并加以修改。分別將12.5 mL H2O2(1.0 mol/L)、12.5 mL FeSO4(1.0 mol/L)加到100 mL的SBP溶液(質量濃度為0.5 mg·mL-1)中,25 ℃ 攪拌2 h。多糖溶液經72 h透析(截留分子質量3 500 Da) 后,真空濃縮、凍干,得到SBDP。

1.3.3多糖分離純化

參照李順峰等[26]的方法,采用DEAE-52纖維素色譜柱對SBP和SBDP進行分離純化,自動采集器收集 (流速為1 mL/min,每管收集10 mL)并測定各組分多糖的回收率。

1.3.4多糖分子質量及單糖組成測定

參照張嘉園[27]的方法并加以修改。采用高效液相色譜法測定SBP和SBDP的分子質量。參照Wang等[28]方法處理樣品,采用離子色譜法分析SBP和SBDP的單糖組成。

1.3.5多糖溶解度、粒徑和pH值的測定

樣品用質量濃度為1.0 mg·mL-1的多糖溶液制備,室溫下用pH計測定其pH值。將10 mg多糖樣品溶于10 mL去離子水中,離心后得上清液,用激光粒度儀對樣品進行粒徑評價。測定溫度為25 ℃ (折射率為1.543,散射角為90°)。參照Chen等[29]的方法測定SBP和SBDP的水溶性。

1.3.6多糖化學鍵分析

參照齊奇等[30]的方法,將干燥的多糖樣品和溴化鉀 (光譜級) 按質量比1∶100混合研磨成粉末,然后壓成薄片,用傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描。掃描范圍為400～4 000 cm-1,以4 cm-1的分辨率掃描16次。

1.3.7多糖結構測定

參照Ma等[24]的方法并加以修改。將多糖(15 mg)室溫下溶解在D2O(0.5 mL)中,并轉移到核磁管中,使用AVANCE Ⅲ HD 500 MHz核磁共振波譜儀獲得1H NMR和13C NMR譜圖。

1.3.8多糖流變特性測定

通過流變儀在(25.0±0.1)℃下,將多糖溶液與平板(d=40 mm)結合。在0.1～100.0 s-1的剪切速率內測試多糖溶液的表觀黏度,在1%的恒定應變和1～100 rad/s的角頻率下測量其儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。

1.3.9多糖吸濕性和保濕性測定

參照Li等[31]的方法。取一定量的多糖樣品置于105 ℃中烘至恒重,精密稱取50 mg,放入相對濕度81%(飽和硫酸銨溶液)的干燥器中。多糖樣品在室溫下每1 h稱重一次,甘油作為陽性對照。吸濕性根據式(1)計算。

(1)

將吸濕飽和的樣品置于裝有變性硅膠的干燥器中。在室溫下進行保濕實驗,每1 h稱重一次。保濕性根據式 (2) 計算。

(2)

式(1)、(2)中,m代表飽和的樣品質量,mg;mt是處理一定時間后的樣品質量,mg;m0是質量恒定的樣品質量,mg。

1.3.10多糖的體外抗氧化活性測定

1.3.10.1 DPPH自由基清除活性測定

參照Xu等[8]的方法,將1.0 mL的DPPH溶液(0.2 mmol/L)與1.0 mL的SBP或SBDP溶液(質量濃度為0.2～2.0 mg·mL-1) 混合,25 ℃避光孵育 30 min, 于517 nm處測定吸光度,以抗壞血酸(VC) 為陽性對照。根據式(3)計算多糖清除率。

(3)

式(3)中,A0為用去離子水代替樣品時,溶液的吸光度;A1為樣品溶液和標準液混合物的吸光度;A2為用乙醇代替標準液與樣品溶液混合物的吸光度。

1.3.10.2 ABTS+自由基清除活性測定

參照魏晨業(yè)等[32]的方法,取4.0 mL ABTS工作液,加入1.0 mL不同質量濃度(0.2～2.0 mg·mL-1) 的多糖溶液,混合,避光反應6 min,于734 nm波長處測定吸光度。以VC為陽性對照,按式(4)計算樣品ABTS+自由基清除率。

(4)

式(4)中,A0為用去離子水代替樣品時對照溶液的吸光度;A1為樣品溶液和標準液混合物的吸光度;A2為用乙醇代替標準液與樣品溶液混合物的吸光度。

1.3.10.3 羥基自由基清除活性測定

參照譚詩敏[33]的方法,將1.0 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)和1.0 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L) 完全混合,加入不同質量濃度 (0.2～2.0 mg·mL-1)的多糖溶液,混勻后加入1.0 mL H2O2溶液 (9 mmol/L) 啟動反應,37 ℃水浴30 min,于510 nm波長處測定吸光值。以VC作為陽性對照,根據 式 (5) 計算自由基清除率。

(5)

式(5)中,A0為用去離子水代替樣品時對照溶液的吸光度;A1為樣品溶液和標準液混合物的吸光度;A2為用乙醇代替標準液與樣品溶液混合物的吸光度。

1.4 數據處理

每個樣品進行3次獨立重復實驗,使用SPSS 22.0對所有實驗數據進行統(tǒng)計學分析。結果使用平均值±標準差表示,P<0.05表示結果差異具有顯著性。采用Origin Pro 2021軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 多糖純化結果及回收率分析

SBP和SBDP經 DEAE-52纖維素樹脂分級洗脫實驗,結果如圖1。由圖1可知,SBP分離得到5個組分,分別為SBP-0、SBP-0.1、SBP-0.2、SBP-0.3、SBP-0.4。SBDP分離得到3個組分,分別為SBDP-0、SBDP-0.1、SBDP-0.2。SBP-0和SBDP-0是通過蒸餾水洗脫下來的,為中性多糖,其余組分通過鹽溶液洗脫,為酸性多糖。所得的各組分含量及回收率,見表1。由表1可知,SBP與SBDP的蒸餾水洗脫組分回收率最高,質量分數分別為38.92%和49.10%。后續(xù)實驗均選擇收集蒸餾水洗脫的組分制備SBP和SBDP。

表1 多糖洗脫回收率

圖1 SBP與SBDP洗脫曲線Fig.1 Elution curves of SBP and SBDP

2.2 降解對SBP的理化性質分析

多糖理化性質分析結果見表2。由表2可知,與SBP相比,SBDP分子質量由3.016×105Da下降到2.902×104Da,平均粒徑由(302.46±3.63)nm下降到(237.30±1.76)nm。H2O2-Fe2+降解多糖是基于Fenton反應生成大量羥自由基,通過羥自由基攻擊分子間或分子內的氫鍵,破壞多糖的聚集[15],顯著降低多糖分子質量和粒徑。相比SBP,SBDP的溶解度增加了20.72%,可能是SBDP糖環(huán)上的碳1(C1)、碳4(C4)及碳5(C5)處的氫原子被羥自由基提取,使SBDP含有更多的羥基、羧基等親水基團[34]。通過H2O2-Fe2+降解多糖,可有效提高多糖溶解度[35]。

表2 SBP和SBDP理化性質

單糖組成的分析結果如表2。SBDP的單糖組成與SBP相似,主要由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸組成,其中半乳糖醛酸是SBP主要成分,甘露糖是SBDP主要成分。半乳糖醛酸含量經H2O2-Fe2+處理后降低,說明SBP中高半乳糖醛酸區(qū)的糖苷鍵和半乳糖醛酸殘基可能被羥自由基攻擊,產生半乳糖醛酸含量占比更低的組分,并暴露出更多的甘露糖[36]。 H2O2-Fe2+降解多糖具有高效且溫和的特點且?guī)缀醪黄茐亩嗵且患壗Y構[8]。

2.3 降解對SBP的結構特征的影響

2.3.1紅外光譜分析

圖2 SBP和SBDP的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of SBP and SBDP

2.3.2核磁共振波譜分析

SBP和SBDP的1H和13C譜圖如圖3。由圖3可知,2種多糖在δH3.0～5.5和δC60～110處出現(xiàn)了幾乎相同的典型多糖峰的分布[23],其中δH為4.3～5.3和δC為90～110的多糖峰信號表明,存在α和β構型糖苷鍵[18]。根據文獻[14]和[44]的研究結果對單糖殘基的信號進行了歸屬,氫-1/碳-1的異常區(qū)(H-1/C-1)所對應的糖苷鍵,組成分析結果如表3[9,23,45]。表3結果表明,SBP和SBDP的主鏈由7種相同的糖苷鍵組成,證明這2種多糖具有相似的主干結構。此外,δH為1.10和δC為16.75 附近的共振信號歸因于鼠李糖的CH3基團,δH為2.07和δC為20.23附近的共振信號證明多糖中存在乙?；鶊F,而δC在170附近的化學位移表明,糖鏈中存在糖醛酸[46]。

表3 SBP和SBDP的糖苷鍵組成

圖3 SBP和SBDP的核磁共振1H譜和13C譜Fig.3 1H and 13C NMR spectra of SBP and SBDP

從單糖組成、FT-IR光譜和核磁共振光譜來看,甘露糖是SBDP中主要的多糖組分,可能以(1→3,6)-α-D-Manp為骨架,(1→4)-α-D-GalpA和(1→2)-α-L-Rhap為主要側鏈。研究結果證明,H2O2-Fe2+處理并沒有改變SBP的一級結構。

2.4 降解對SBP的吸濕性和保濕性的影響

多糖吸濕性和保濕性檢測結果,見圖4。由 圖4(a) 可知,多糖和甘油的吸濕率隨時間延長而增大,且SBDP吸濕率一直高于SBP。當吸濕時間達到12 h時,SBP和SBDP的吸濕能力趨于飽和,最大吸濕率分別為40.67%±0.35%和 42.67%±0.12%,證明SBDP吸濕性能遠強于SBP。由 圖4(b) 可知,多糖和甘油的保濕率均隨時間的延長而下降。保濕4 h內,甘油保濕能力明顯高于SBP和SBDP。保濕5 h后,SBP和SBDP的保濕能力趨于穩(wěn)定,最大保濕率分別為24.24%±0.94%和26.56%±0.69%,均高于甘油(17.36%±0.07%)。多糖的吸濕性和保濕性是由多糖分子中親水基團與水分子形成氫鍵所表現(xiàn)的效果,與多糖分子中的親水基含量相關[46]。同時,多糖鏈可以相互交織,形成網狀結構,這對保持水分含量很重要[47]。H2O2-Fe2+處理使得SBDP具有更多羥基、羧基等親水基團,并且SBDP多糖鏈更容易形成網狀結構?；诖私Y果,SBDP有望開發(fā)為保濕劑。

圖4 SBP和SBDP的吸濕和保濕能力Fig.4 Hygroscopicity and moisturizing property of SBP and SBDP

2.5 降解對SBP的流變特性的影響

具有良好流變性的多糖可以用作食品行業(yè)的增稠劑、凝膠劑、混懸劑和乳化劑[48]。多糖的流變特性檢測結果,見圖5。由圖5可知,2種多糖溶液均表現(xiàn)出剪切稀化特性和牛頓流體行為,且SBDP的溶液黏度始終低于SBP。在低剪切速率下,多糖黏度隨著剪切速率的增加而降低,多糖溶液表現(xiàn)出典型的剪切稀化行為。這種現(xiàn)象是由于多糖分子的鏈-鏈結構被剪切力破壞,導致黏度下降[48]。同時,高分子質量多糖的分子間相互作用力強于低分子量多糖,導致多糖鏈更容易纏結[49]。在高剪切速率下,較長的多糖鏈可能解開纏繞,2種多糖的表觀黏度保持穩(wěn)定,多糖溶液性質更接近牛頓流體[23]。

圖5 SBP和SBDP的流變特性Fig.5 Rheological characterization of SBP and SBDP

儲能模量(G′)為彈性應力應變之比,損耗模量(G″)為黏性應力應變之比。G′和G″的交叉點可用于確定多糖溶液的線性黏彈性區(qū)域[50]。由圖5可知,2種多糖的G′和G″均隨角頻率的升高而增加。在低頻區(qū)域,G″大于G′,表示多糖呈現(xiàn)液體黏性[49]。而在高頻區(qū)域,G′大于G″,此時多糖溶液表現(xiàn)出弱凝膠狀特性[48]。SBDP交匯點 (3.98 rad/s) 低于SBP交匯點(5.12 rad/s),由于多糖鏈之間連接點的數量和復雜性增加,SBDP更有可能在水溶液中形成強大的分子間(或分子內)相互作用力和糾纏網絡[48]。實驗結果表明,降解處理使多糖具有更好的凝膠性能和體系穩(wěn)定性[23-24]。

2.6 降解對SBP體外抗氧化活性的影響

將所得到的SBP和SBDP按比例稀釋進行體外抗氧化活性測定,并與VC的抗氧化活性進行對比,研究結果如圖6。由圖6可知,SBP對DPPH自由基清除能力具有濃度依賴性。當多糖質量濃度為0.4 mg·mL-1時,SBP和SBDP對DPPH自由基清除能力無明顯差異。但隨著多糖質量濃度增加(0.6～2.0 mg·mL-1),SBDP的DPPH自由基清除能力明顯高于相同質量濃度的SBP(P<0.05)。在質量濃度為2.0 mg·mL-1時,SBDP對DPPH自由基的清除能力顯著高于SBP(P<0.05),達到89.44%±0.12%。同時,SBP和SBDP的半抑制濃度(IC50值)分別為1.06 mg·mL-1和0.71 mg·mL-1,證明SBDP對DPPH自由基清除效果更好。H2O2-Fe2+處理提高了多糖供氫能力,使SBDP更容易與DPPH自由基反應生成穩(wěn)定的產物,從而提高了對DPPH自由基清除能力[35]。

不同字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖6 SBP和SBDP對自由基的清除活性Fig.6 Scavenging activities of SBP and SBDP on radical

由圖6可知,ABTS+自由基清除能力與多糖質量濃度的增加具有良好的相關性,自由基清除能力與多糖質量濃度成正比。當多糖質量濃度達到2.0 mg·mL-1時,SBP和SBDP的ABTS+自由基清除率分別為93.37%±0.13%和96.09%±0.22%,IC50值分別為0.22 mg·mL-1和0.21 mg·mL-1。SBDP的自由基清除能力更好,清除效果接近VC(99.15%±0.37%)。研究表明多糖的官能團中,自由羥基可能通過提供電子將自由基還原為更穩(wěn)定的形式,或者通過直接與自由基反應終止自由基連鎖反應而參與抗氧化作用[15]。結果說明,SBP糖環(huán)中C5處的氫原子可能被H2O2-Fe2+產生的羥自由基提取,SBP糖環(huán)被打開,暴露出更多的自由羥基[51],從而顯著提高SBDP的ABTS+自由基清除能力。

由圖6可知,隨著多糖濃度的提高,2種多糖的羥基自由基清除能力均呈現(xiàn)上升趨勢,且在相同濃度下,SBDP的清除能力始終高于SBP。SBP和SBDP對羥基自由基清除的IC50值分別為0.90 mg·mL-1和0.56 mg·mL-1。多糖質量濃度為2.0 mg·mL-1時,SBDP的羥基清除能力顯著增強 (P<0.05),達到73.26%±1.16%。與SBP相比,SBDP具有更強的羥基自由基清除活性。在清除羥基自由基反應中,多糖作為電子供體或氫供體參與反應中[52],而H2O2-Fe2+處理導致SBDP的分子質量更低,使其成為更好的電子或氫的供體,同時,SBDP具有更好的水溶性,這可能導致SBDP中的化學基團與羥基自由基相互作用的機會增加,提升SBDP分子的反應效率,使得SBDP表現(xiàn)出更強的羥基自由基清除能力[11]。

通過上述結果可知,經H2O2-Fe2+降解所得到的SBDP具有良好的抗氧化活性,且隨著濃度的提升,對DPPH自由基、ABTS+自由基及羥基自由基的清除能力均優(yōu)于SBP。

3 結 論

本研究對SBDP的結構表征、功能特性和抗氧化活性進行了分析。SBDP和SBP是含有相同單糖的雜多糖,其主鏈主要由相同的7種糖苷鍵組成。SBDP(2.902×104Da)的分子質量明顯低于SBP(3.016×105Da),說明H2O2-Fe2+法是制備低分子質量SBDP的有效方法。SBDP水溶性更高,表觀黏度更低,低剪切速率下為假塑性流體,表現(xiàn)出黏彈性行為,具有較強的抗氧化活性。但SBDP的體內生物活性和構效關系有待進一步研究。