負(fù)載2種益生菌的多核微膠囊制備方法及特性研究

常詩(shī)晗, 烏日娜, 方海田, 劉曉燕, 滕政蓉, 任廣鈺,張 英, 劉慧燕,*, 武俊瑞,*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 沈陽 110866;2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心, 遼寧 沈陽 110866;3.寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川 750021;4.沈陽市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽 110866;5.寧夏伊品生物科技股份有限公司, 寧夏 銀川 750001)

雙歧桿菌是一種嚴(yán)格厭氧的益生菌,具有預(yù)防腸道感染,降低膽固醇水平,維持腸黏膜屏障完整性和抵抗病原體在腸道定植等一系列促進(jìn)健康的特性[1-2]。在食品加工過程中以及在到達(dá)結(jié)腸之前的胃腸道運(yùn)輸過程中,雙歧桿菌的生存能力經(jīng)常受到阻礙。許多益生菌對(duì)胃中低pH值和近端腸內(nèi)高濃度的膽鹽環(huán)境都很敏感,在暴露于胃液時(shí)會(huì)失活[3]。益生菌在宿主體內(nèi)達(dá)到預(yù)期效果,其活菌數(shù)必須在106CFU/g以上[4]。因此,為雙歧桿菌創(chuàng)造嚴(yán)格的生長(zhǎng)環(huán)境以及開發(fā)有效保護(hù)益生菌活性的技術(shù)具有重要意義。

微膠囊化包埋技術(shù)可以保護(hù)益生菌免受外部環(huán)境和胃腸道的不利條件的影響,提供足夠的細(xì)菌數(shù)量,實(shí)現(xiàn)其益生作用,并延長(zhǎng)其生命周期[5]。合理運(yùn)用微膠囊技術(shù)和壁材,可提高包埋率與穩(wěn)定性,將微膠囊的粒徑控制在一個(gè)合適的范圍內(nèi)[6-7],也可以使其在特定條件下釋放[8-9]。 內(nèi)源乳化法和擠壓法在微膠囊實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛[10],是可行的益生菌保護(hù)、應(yīng)用和控釋技術(shù)。Holkem等[11]通過內(nèi)源乳化法制備雙歧桿菌BB-12微顆粒,并對(duì)其鈣離子緩釋效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,微球?qū)﹄p歧桿菌BB-12具有保護(hù)作用,在pH值7.5的條件下呈現(xiàn)出釋放性。擠壓法操作溫和、簡(jiǎn)單、成本低,且不涉及任何有害溶劑,能夠減少細(xì)胞的損傷,提高包埋效率[12]。此方法使用的材料中以海藻酸鈉作為壁材的固定化應(yīng)用最多。海藻酸鹽是一種常用于固定活細(xì)胞的聚合物,具有很強(qiáng)的交聯(lián)能力和不同分子質(zhì)量的溫和膠凝特性[13],有生物相容性好、無毒、可生物降解和低成本的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于益生菌微膠囊的制備中[14]。然而,僅由海藻酸鹽制成的益生菌膠囊表面較粗糙,有孔隙和裂縫,所形成的凝膠孔隙可達(dá)5～200 nm[15]。在較低的pH值溶液時(shí)(例如在胃腸道條件下),單獨(dú)的海藻酸鈉不能有效地阻隔胃酸的滲入,無法更好地保護(hù)益生菌[16-17]。將海藻酸鹽與其他聚合物混合能夠增強(qiáng)微膠囊對(duì)酸性介質(zhì)的耐受性,從而提高益生菌的存活率[18]。Han等[19]利用海藻酸鈣-乳清蛋白分離物為壁材制備保加利亞乳桿菌和副干酪乳桿菌微膠囊,結(jié)果表明微膠囊中益生菌的存活率從3%提高到了41.26%。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)益生菌微膠囊的研究大多停留在方法和壁材上,且混合益生菌微生態(tài)制劑普遍存在活性保持與協(xié)同作用技術(shù)難題,關(guān)于益生菌微膠囊在實(shí)現(xiàn)分隔包埋以及在胃腸道的緩釋情況方面的研究甚少。本研究擬對(duì)B.adolescensFS2-3和B.subtilisSN15-2進(jìn)行微膠囊雙菌分隔包埋,希望為防止益生菌菌株的直接接觸抑制,創(chuàng)造一個(gè)良好的環(huán)境。采用海藻酸鈉為壁材,同時(shí)添加巰基化羧甲基纖維素鈉(CMC-SH)加強(qiáng)益生菌在腸道內(nèi)的黏附性。研究益生菌在模擬胃腸道中活力變化及釋放特性,并觀察微膠囊在儲(chǔ)存期間活菌數(shù)的變化。研究旨在為解決雙歧桿菌不耐人體胃腸道惡劣環(huán)境的問題,以及具有腸道緩釋功能的益生菌微膠囊分隔包埋問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉、氯化鈣、碳酸鈣、磷酸鹽緩沖液、醋酸、氫氧化鈉、鹽酸,Biowest 公司;CMC-SH、CMC、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、半胱氨酸鹽酸鹽、氯化鈉、吐溫-80、冰乙酸、胃蛋白酶、磷酸二氫鉀、膽鹽、胰蛋白酶,北京化工廠;金龍魚大豆油,家樂福超市;N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、二硫蘇糖醇(DTT),北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG-16G型低溫高速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;LGJ-10N/A型真空冷凍干燥機(jī),上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司;S-4800型掃描電子顯微鏡,日本日立高科技公司;BX43型顯微鏡,日本奧林巴斯公司;Secura 225D-1CN型天平,北京Sartorius公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器,日本三洋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化

青春雙歧桿菌(B.adolescensFS2-3)活化:取-80 ℃超低溫冰箱中甘油保藏的菌株解凍,在雙歧桿菌固體培養(yǎng)基上劃線,放置在含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、5%的H2、90%的N2的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。復(fù)蘇后,挑取單菌落染色鑒定后,接種于雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種比例接入雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中傳代。

枯草芽孢桿菌(B.subtilisSN15-2)活化:將-80 ℃超低溫冰箱中甘油保藏的菌株解凍,取一定菌液于LB固體培養(yǎng)基平板上劃線,37 ℃過夜培養(yǎng)。接種環(huán)挑取菌落,接入LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h,備用。

1.3.2CMC-SH與海藻酸鈉復(fù)合薄膜的制備

1.3.2.1 CMC-SH的制備

參照Deng等[20]方法,并稍加修改。將0.10 g CMC溶解在20 mL的超純水中,加入0.22 g EDC·HCl和 0.13 g NHS, 調(diào)節(jié)pH值至4.8,于25 ℃下攪拌 2 h, 然后加入0.475 g半胱氨酸鹽酸鹽,用超純水透析24 h。透析后,加入0.295 g DTT,pH值調(diào)為8.5,置于室溫反應(yīng)24 h。鹽酸調(diào)節(jié)0.1 mol/L NaCl溶液至pH值為3.5,用于混合物透析。透析24 h后,再用pH 值3.5的HCl溶液透析48 h,凍干。

1.3.2.2 復(fù)合薄膜的制備

分別稱量1 g的CMC和CMC-SH溶解于20 mL蒸餾水中。再稱取0.6 g海藻酸鈉加入上述溶液中,放置于25 ℃搖床中,溶脹4 h。取300 mg甘油加入溶液中,并超聲處理2～3 min。將溶液分裝倒入直徑為7 cm的平底模具中,置于60 ℃烘箱中干燥6 h。再放于50%濕度、25 ℃條件下干燥48 h,備用。單一的海藻酸鈉薄膜制備方法同上。

1.3.3微膠囊的制備方法

1.3.3.1 內(nèi)芯微球的制備

采用內(nèi)源乳化法制備內(nèi)芯微球,參照李龍等[21]的方法,略有修改。取1 mLB.adolescensFS2-3(1×108CFU/mL)于1.5 mL離心管中,并按菌液體積的1%加入CMC-SH混合。將20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%海藻酸鈉和0.1 g CaCO3與上述菌液充分混合,用滅菌水補(bǔ)足至60 mL。向混合液中加入含有質(zhì)量濃度2 g/L吐溫-80的大豆油180 mL。放置于400 r/min磁力攪拌器上乳化5 min。加200 μL乙酸繼續(xù)乳化10 min。乳化后加滅菌蒸餾水使混合液分層,待凝膠成型的微膠囊都沉降到溶液底部后,吸去油相,離心收集微膠囊并洗滌3次,去除表面油相和菌體,保存好備用。

1.3.3.2 外殼微球的制備

采用擠壓法制備外殼微球,配制50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的海藻酸鈉,200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈣于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。取1 mLB.subtilisSN15-2(1×108CFU/mL)與1.3.3.1節(jié)制得的1 mL濕微球混合。將菌球混合液按體積比1∶1和海藻酸鈉充分混合,菌膠混合液在注射泵的壓力下,通過注射器和毛細(xì)管制得的微通道,進(jìn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈣溶液中,攪拌鈣化15 min。離心后洗滌,收集得到益生菌雙菌微膠囊。

1.3.4微膠囊制備條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以包埋率為考察指標(biāo)考察不同因素對(duì)益生菌雙菌微膠囊的影響,綜合分析后選擇了6種因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見表1。

表1 單因素變量

1.3.4.1 內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程保持CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球比例為1∶1。按照不同內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%制備微膠囊。

1.3.4.2 CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球比例為 1∶1。按照CMC-SH在菌液中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)制備微膠囊。

1.3.4.3 水相和油相體積比的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球體積比為1∶1。按照不同水相與油相體積比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)制備微膠囊。

1.3.4.4 外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球體積比為1∶1。按照不同外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)制備微膠囊。

1.3.4.5 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,菌液與內(nèi)芯微球體積比例為1∶1。按照不同氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)制備微膠囊。

1.3.4.6 菌液和內(nèi)芯微球比例的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。按照不同菌液與內(nèi)芯微球體積比(1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1)制備微膠囊。

1.3.5微膠囊包埋工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采取四因素三水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以包埋率為響應(yīng)值,利用Design Expert進(jìn)行分析。各因素及水平設(shè)置如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.6微膠囊包埋率的測(cè)定

參照Fritzen等[22]的方法,并稍加修改。稱取制成的益生菌雙菌微膠囊1 g,加入9 mL解囊液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的檸檬酸三鈉)中,置于37 ℃搖床中振蕩。促使微膠囊中的益生菌完全釋放進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。經(jīng)過梯度稀釋后,將菌懸液分成2份,1份涂布于雙歧桿菌固體培養(yǎng)基上,于厭氧箱中培養(yǎng)24 h。另1份涂布于LB固體培養(yǎng)基上,置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,統(tǒng)計(jì)總菌數(shù)。根據(jù) 式(1) 計(jì)算微膠囊包埋率。

(1)

式(1)中,N0為制備微膠囊時(shí)起始添加的活菌數(shù),CFU/g;N1為微膠囊中包埋的活菌數(shù),CFU/g。

1.3.7微膠囊的結(jié)構(gòu)形貌觀察

采用掃描電鏡(SEM)觀察微膠囊冷凍干燥后的形態(tài)。用雙面膠帶固定在微膠囊表面,吹去多余粉末。樣品通過濺射鍍銅管鍍金2.5 min,將微膠囊置于載玻片上,采用光學(xué)顯微鏡在10～100倍觀察微膠囊形貌。

1.3.8微膠囊在模擬人工胃腸液中釋放率的測(cè)定

1)模擬人工胃液制備。參照劉月靜[23]的方法,并稍加修改。取質(zhì)量濃度為2 g/L NaCl溶液,調(diào)pH值至2。取3 g胃蛋白酶,加入NaCl溶液中充分混勻,用0.22 μm濾膜過濾除菌,現(xiàn)用現(xiàn)配。

2)模擬人工腸液配制。基于Afzaal等[24]的方法,并稍加修改。取 6.8 g K2HPO4,用500 mL蒸餾水溶解,NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8。另取10 g胰酶,加適量的水使其溶解,將2種溶液混合,并加水定容至1 000 mL,濾膜過濾,現(xiàn)用現(xiàn)配。

3)解囊液的配制。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的檸檬酸三鈉,溶解于50 mL蒸餾水中,121 ℃滅菌20 min備用。

稱量1 g微膠囊,用無菌水充分洗滌。再將微膠囊加入9 mL預(yù)熱的人工胃液中處理2 h后,轉(zhuǎn)移至9 mL預(yù)熱的人工腸液中,于37 ℃,100 r/min水浴搖床中振蕩1 h,每隔一段時(shí)間取1管樣品。根據(jù)式(2)計(jì)算微膠囊釋放率。

(2)

式(2)中,A為人工胃腸液處理后的活菌數(shù),CFU/g;B為人工胃腸液處理前的活菌數(shù),CFU/g。

1.3.9微膠囊的儲(chǔ)存穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

基于姚澤晨[25]的方法,并稍加修改。將益生菌雙菌微膠囊分裝于2 mL離心管中,在4、25 ℃溫度條件下保存6周。每周取1管,評(píng)價(jià)儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異具有顯著性,同時(shí)利用Origin 2020軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同單因素對(duì)益生菌包埋率的影響

2.1.1內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

海藻酸鈉對(duì)益生菌包埋率影響見圖1。由圖1可知,隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,包埋率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2% 時(shí),包埋率達(dá)到最大,與其他組有明顯差異性。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低時(shí),膠囊的外壁過薄,機(jī)械強(qiáng)度較弱,不能有效包埋菌體。而當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于2%時(shí),溶液黏度和密度也會(huì)隨之變大,這使得凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的空隙無法容納更多芯材,影響成球效果[26]。因此,內(nèi)芯海藻酸鈉較優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖1 內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on inner core on probiotic embedding rate

2.1.2CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

CMC-SH對(duì)益生菌包埋率影響見圖2。由圖2可知,隨著CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,微膠囊的包埋率增加,當(dāng)CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí),微膠囊包埋率最大,CMC-SH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大會(huì)不利于益生菌的包埋。CMC-SH的添加使海藻酸鈉凝膠孔隙變小,有效提高微膠囊對(duì)益生菌的保護(hù)作用。而CMC-SH本身就具有一定黏彈性,質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大會(huì)使要包埋的菌體分散較為困難,不利于溶解,進(jìn)而引起包埋率降低。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)包埋達(dá)到較佳效果,而質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%以上時(shí)已經(jīng)不利于包埋,影響益生菌包埋率。因此,選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CMC-SH進(jìn)行包埋。

2.1.3水相與油相體積比對(duì)益生菌包埋率的影響

水相油相體積比對(duì)益生菌包埋率的影響見 圖3。 由圖3可知,隨著水相油相體積比的改變,微膠囊的包埋率也隨之變化。當(dāng)油相體積過小時(shí),形成微球之間摩擦力過大,影響包埋率。而油相體積增加過大時(shí),單位體積豆油中海藻酸鈉含量過高,過多的菌體進(jìn)入囊結(jié)構(gòu)中導(dǎo)致囊壁變薄,在后續(xù)的攪拌過程中容易致使結(jié)構(gòu)破裂,造成包埋率下降[27-28]。因此,結(jié)合數(shù)據(jù)選用水相與油相體積比為 1∶3,該比值較適于包埋。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。 圖3 水相油相體積比對(duì)益生菌包埋率影響Fig.3 Effect of water-oil volume ratio on probiotic embedding rate

2.1.4外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌生菌包埋率的影響見圖4。由圖4可知微膠囊的包埋率隨外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加,當(dāng)外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3%時(shí),微膠囊包埋率最大,當(dāng)外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí),微膠囊包埋率降低。外層海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低機(jī)械強(qiáng)度弱,不利于保護(hù)益生菌,或質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高黏性較大造成菌體不易分散且不易被擠出,進(jìn)而造成部分益生菌損失[29],同樣會(huì)影響菌體的包埋率。而與用海藻酸鈉制備內(nèi)芯微球的方法不同,所選最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)也會(huì)有所不同。因此,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)以3%為較優(yōu)條件。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖4 外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率影響Fig.4 Effect of sodium alginate concentration in outer layer on probiotic embedding rate

2.1.5氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

氯化鈣對(duì)益生菌包埋率影響見圖5。由圖5可知,隨著氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的改變,對(duì)益生菌的包埋情況也會(huì)不同。當(dāng) CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2%時(shí),隨著CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,包埋率也增大,在氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí),益生菌包埋率最高。隨著氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)升高,包埋率反而下降,原因可能是過高的Ca2+含量會(huì)導(dǎo)致體系內(nèi)交聯(lián)有限造成包埋率下降。周莉等[30]對(duì)保加利亞乳桿菌微膠囊化的研究也發(fā)現(xiàn)相應(yīng)結(jié)果。因此,選用2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈣效果最優(yōu)。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖5 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率影響Fig.5 Effect of calcium chloride concentration on probiotic embedding rate

2.1.6菌液和內(nèi)芯微球比例對(duì)益生菌包埋率的影響

菌液與內(nèi)芯比例對(duì)益生菌包埋率的影響見 圖6。 由圖6可知,菌液和內(nèi)芯微球的混合同樣會(huì)影響益生菌的包埋率,但程度相對(duì)較小。內(nèi)芯微球加入過少,液體里含有球的密度過低,會(huì)降低雙歧桿菌的菌數(shù)。而內(nèi)芯微球較多時(shí),密度過大同樣會(huì)影響包埋率。同樣,當(dāng)菌液的數(shù)量較多,大量的菌游離于溶液體系中,不能被壁材包裹,也會(huì)造成包埋率不高,達(dá)不到預(yù)期效果。當(dāng)菌液和內(nèi)芯微球的比例適中(體積比1∶1)時(shí),壁材很好地把游離菌用致密的網(wǎng)狀海藻酸鈣結(jié)構(gòu)包被。結(jié)合數(shù)據(jù),選用菌液與微球體積比為1∶1時(shí),制備益生菌雙菌微膠囊最好。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖6 菌液和內(nèi)芯微球體積比對(duì)益生菌包埋率影響Fig.6 Effect of volume ratio of bacterial solution to inner core microsphere on probiotic embedding rate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1回歸模型及顯著性分析結(jié)果

采用Box-Behnken design ( BBD ),以包埋率為響應(yīng)值,試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-expert 10.0.7 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到二次多元回歸方程,見式(3)。

Y=72.63-0.99×A-1.60×B-0.87×
C-0.69×D+0.30×AB+0.39×AC+
0.095×AD+0.45×BC+0.78×BD+1.09×
CD-3.08×A2-4.25×B2-5.93×
C2-6.79×D2。

(3)

式(3)中,Y為響應(yīng)值,即包埋率;A為內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù);B為CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù);C為水油體積比;D為外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表4為回歸模型方差分析結(jié)果。由表3可知,模型P值顯著(P<0.000 1),而失擬項(xiàng)不顯著,說明模型具有統(tǒng)計(jì)意義,且實(shí)驗(yàn)的擬合度較好,可用此模型進(jìn)行工藝分析;B2、C2、D2為極顯著;由F值可知,因素對(duì)包埋率的影響由大到小為CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)、內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水油體積比、外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.2響應(yīng)面模型驗(yàn)證

響應(yīng)面立體圖和等高線圖見圖7。等高線是橢圓形可說明2個(gè)因素交互作用顯著,而圓形則相反。根據(jù)立體圖曲面的傾斜度可確定2個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。通過軟件分析,得到益生菌雙菌微膠囊的較佳制備工藝參數(shù):內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.82%,CMC-SH在菌液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%,水油體積比為1.0∶2.9,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.9%。在優(yōu)化條件下計(jì)算出包埋率的理論預(yù)測(cè)值為72.93%。以此為條件,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)的包埋率平均值為72.14%,與模型的理論預(yù)測(cè)值基本接近。

圖7 不同因素交互作用對(duì)包埋率的影響Fig.7 Effect of interaction of different factors on embedding rate

2.3 微膠囊結(jié)構(gòu)的形貌觀察結(jié)果

掃描電子顯微鏡觀察制備的微膠囊結(jié)果見圖8(a)。 由圖8可知,益生菌雙菌微膠囊因受到真空冷凍干燥的影響,失水皺縮呈現(xiàn)凹陷和褶皺結(jié)構(gòu)。微膠囊凍干后粒徑會(huì)減小,且壁材海藻酸鈉形成的微膠囊具有多孔性[31]。表面是致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),沒有顯示裂縫或可見斷裂,限制了酸和酶對(duì)益生菌的影響,包埋益生菌效果較好。根據(jù)光學(xué)顯微鏡觀察[圖8(b)],采用擠壓法制備的濕微膠囊呈內(nèi)外2個(gè)規(guī)則的球形,外殼微球能順利包埋內(nèi)芯微球,成功制成益生菌雙菌微膠囊。

圖8 微膠囊形貌Fig.8 Morphology of microcapsules

2.4 連續(xù)模擬人工胃腸道對(duì)微膠囊釋放率的影響

益生菌在腸內(nèi)釋放是發(fā)揮益生性能的關(guān)鍵,通過測(cè)定釋放率,確定益生菌釋放時(shí)間,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。由圖9可知,雙菌微膠囊在胃液處理2 h的釋放率微乎其微,而單菌微膠囊釋放率已達(dá)到最大值。與單菌微膠囊相比,雙菌微膠囊更能保持菌株在胃液中的活力。在腸液處理150 min后,通過觀察菌落形態(tài)并計(jì)數(shù),雙菌微膠囊中青春雙歧桿菌的活菌數(shù)明顯增多,枯草芽孢桿菌已經(jīng)釋放出來。隨著時(shí)間的變化,溶液中的微膠囊也逐漸崩解,在180 min時(shí),釋放率達(dá)到86.3%,微膠囊基本完全崩解。Luo等[32]利用復(fù)合材料制備的植物乳桿菌微膠囊也可以保護(hù)模擬胃液中益生菌的活力,并在模擬腸液中更好釋放益生菌,能順利將其定殖到腸道。海藻酸鈉在模擬人工胃液中會(huì)發(fā)生質(zhì)子化,當(dāng)微膠囊進(jìn)入腸液后更易溶脹,進(jìn)而加快釋放速度。

圖9 微膠囊在連續(xù)模擬人工胃腸液中的釋放率Fig.9 Release rate of microcapsules in continuous simulated artificial gastroenteric fluid

2.5 不同貯藏條件對(duì)微膠囊益生菌活性的影響

益生菌通過微膠囊化,可以在加工過程中提高菌株活菌數(shù),免受外界環(huán)境影響。選擇一個(gè)合適的溫度貯藏益生菌微膠囊,保證益生菌存活率至關(guān)重要[33]。微膠囊貯藏穩(wěn)定性見圖10。由圖10可知, 4 ℃和 25 ℃ 貯藏溫度下,益生菌雙菌微膠囊的貯藏存活率都高于2種游離菌株。對(duì)比2種溫度下益生菌的存活率,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),在42 d后, 4 ℃ 條件下的微膠囊中菌株存活率能達(dá)到66.13%,較 25 ℃條件下菌株的存活率60.71%更高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),4 ℃條件下微膠囊具有良好的穩(wěn)定性,適合貯藏益生菌雙菌微膠囊。

不同字母表示同一貯藏時(shí)間益生菌存活率差異顯著(P<0.05)。 圖10 微膠囊在不同溫度下貯藏的存活率Fig.10 Survival rate of microcapsules stored at different temperatures

3 結(jié) 論

本研究制備的益生菌雙菌微膠囊,將2種益生菌封裝到不同隔間,包裹在同一微膠囊內(nèi)。通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到益生菌雙菌微膠囊的最優(yōu)制備工藝參數(shù):內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.82%;CMC-SH在菌液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%;水油體積比1.0∶2.9;外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.9%。益生菌雙菌微膠囊可提高益生菌在胃腸道的活性并能在腸道內(nèi)充分釋放益生菌。不同溫度貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,益生菌雙菌微膠囊在4 ℃條件貯藏比在25 ℃條件下貯藏具有更高的存活率。制備的微膠囊能夠解決益生菌不耐人體胃腸道惡劣環(huán)境的問題,希望研究結(jié)果可為具有腸道緩釋功能的益生菌微膠囊分隔包埋研究開辟新的思路。