基于恒溫催化反應(yīng)過程中吸光度實(shí)時測定的漆酶活性快速測定

田曉麗，姜文俠*，張笑然，付紹平，孫瑞雪

（1.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；2.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3.國家合成生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308）

酶活性是酶和酶制劑的挖掘、創(chuàng)制、研究、生產(chǎn)、分離純化及應(yīng)用的一個必不可少的參數(shù)，以其在特定的溫度等試驗(yàn)條件下所催化的反應(yīng)的速率表示[1-4]?，F(xiàn)有測定酶活性的“兩點(diǎn)法”從混合試液啟動酶催化反應(yīng)到終止反應(yīng)的酶催化反應(yīng)時長往往長達(dá)數(shù)分鐘甚至數(shù)十分鐘[5-12]，不能滿足高通量測定的需要，不能實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)控聯(lián)動控制要求的實(shí)時分析。另一方面，如果酶催化反應(yīng)時長延長到酶的初始催化反應(yīng)速率以外（圖1中的BC時間段），則測定值降低，影響到酶活性檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和可比性[13]。酶制劑評價體系與標(biāo)準(zhǔn)體系的不統(tǒng)一，尤其體現(xiàn)在工業(yè)酶制劑領(lǐng)域，酶活性標(biāo)準(zhǔn)和應(yīng)用性能評價差異較大，無法客觀評價國內(nèi)外酶制劑以及國內(nèi)不同廠家酶制劑產(chǎn)品特性。

圖1 酶催化反應(yīng)速率曲線Fig.1 Enzymatic reaction rate curve

本文搭建了一個在酶的恒溫催化反應(yīng)過程中進(jìn)行吸光度檢測的恒溫反應(yīng)分光光度系統(tǒng)，酶的催化反應(yīng)在分光光度計(jì)的比色皿中進(jìn)行，以水浴恒溫比色皿架夾層的循環(huán)水準(zhǔn)確控制比色皿內(nèi)酶催化反應(yīng)體系的溫度，可以精確地測定催化過程中反應(yīng)體系吸光度、透光率的實(shí)時變化值。以漆酶活性的測定為研究對象，選用了漆酶活性檢測中使用最多的 2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽 [2，2'-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS]作為底物，考察了ABTS濃度、溶氧濃度和酶濃度的適宜范圍，建立了基于初始催化反應(yīng)速率的漆酶活性快速測定方法，大幅度簡化了操作流程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漆酶通過冬生多孔菌（Polyporus brumalis TIB.BPE 11072，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所保藏）液體發(fā)酵獲得，制備的原酶液濃度為n。ABTS：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì)（TU-1810PC）、水浴恒溫比色皿架（CH181-1）：中國PERSEE公司；恒溫循環(huán)水?。≒roline RP1845C）：德國LAUDA公司；溶氧測定儀（HQ40d）：美國HACH公司。

1.3 恒溫反應(yīng)分光光度系統(tǒng)

紫外-可見分光光度計(jì)使用水浴恒溫比色皿架，通過管路外接高精度的恒溫循環(huán)水浴，以準(zhǔn)確控制比色皿內(nèi)反應(yīng)體系的溫度。酶的恒溫催化反應(yīng)進(jìn)行的同時檢測該反應(yīng)體系的吸光度。

1.4 漆酶催化的產(chǎn)物濃度、底物ABTS濃度及漆酶活性的測定

將濃度為n的原酶液適當(dāng)稀釋，制備待測酶液。

取2.7 mL 0.05 mol/L pH5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和0.2mL特定濃度的ABTS溶液置于光程為1 cm的比色皿中，加入0.1mL待測酶液，振蕩混合啟動反應(yīng)，將比色皿置于水浴恒溫比色皿架內(nèi)，于波長420 nm實(shí)時測定酶催化反應(yīng)體系的吸光度。以加熱煮沸5 min的相同濃度的滅活待測酶液作對照。

1.4.1 產(chǎn)物濃度

產(chǎn)物濃度的計(jì)算公式如下。

式中：CP為產(chǎn)物濃度，mmol/L；A為420 nm處的吸光度值；ε420為ABTS氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)，36 000 L/（mol·cm）。

1.4.2 底物ABTS濃度

底物ABTS濃度的計(jì)算公式如下。

式中：CABTS為 ABTS 濃度，mmol/L；CABTS-i為反應(yīng)體系中初始ABTS濃度，mmol/L；A為420nm處的吸光度值；ε420為ABTS氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)，36000L/（mol·cm）。

1.4.3 底物ABTS的轉(zhuǎn)化率

底物ABTS的轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下。

式中：R為底物ABTS的轉(zhuǎn)化率，% ；A為420nm處的吸光度值；CABTS-i為反應(yīng)體系中初始ABTS濃度，mmol/L；ε420為ABTS氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)，36 000 L/（mol·cm）。

1.4.4 漆酶活性

漆酶活性定義：以每分鐘氧化1 μmol的ABTS所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。漆酶活性計(jì)算公式如下。

式中：U為待測酶液的漆酶活性，U/mL；V為反應(yīng)總體積，mL；A1和A2為兩個不同檢測時間點(diǎn)的420 nm吸光度值；v為待測酶液的體積，mL；t為檢測時長，即A1和A2兩個檢測時間點(diǎn)之間的時間間隔，min；L為比色皿的光程，cm。

1.5 漆酶催化反應(yīng)體系中溶氧濃度的測定

將裝有0.05 mol/L pH5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和特定濃度ABTS溶液的試劑瓶充分振蕩后置于設(shè)定溫度的恒溫水浴中，將溶氧測定儀探頭浸于試劑瓶的液體中，待溶氧濃度恒定后，加入1 mL待測酶液，振蕩混合，連續(xù)測定反應(yīng)體系中的溶氧濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活性檢測過程中底物和溶氧濃度的適宜范圍

在不同溫度考察漆酶活性檢測的反應(yīng)體系中，當(dāng)ABTS濃度足夠大時溶氧的變化，以及當(dāng)溶氧濃度足夠大時ABTS的變化規(guī)律，尋找在設(shè)定的酶活性測定反應(yīng)過程中適宜的溶氧濃度范圍和適宜的ABTS濃度范圍，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溫度的漆酶活性測定體系中溶氧濃度、ABTS濃度及產(chǎn)物濃度的變化Fig.2 Changes of dissolved oxygen concentration，ABTS concentration and product concentration in laccase activity detection system at different temperatures

由圖2可知，反應(yīng)體系中的ABTS濃度和溶氧濃度表現(xiàn)出一致的變化趨勢：起初其濃度足夠高時，漆酶催化反應(yīng)速率最大并在短時間內(nèi)保持不變，此時的催化反應(yīng)速率為初始催化反應(yīng)速率；在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，初始催化反應(yīng)速率增大；但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，ABTS或溶氧消耗，催化反應(yīng)速率逐漸減小，甚至趨向于零；在圖2a中，由于溫度升高反應(yīng)體系中初始溶氧濃度呈現(xiàn)顯著的降低趨勢。對比圖2a和圖2b，當(dāng)ABTS濃度足夠大時，溶氧含量逐漸趨近零；而即便溶氧濃度足夠大也不能使ABTS全部被催化氧化成產(chǎn)物。

酶濃度（Clac）和 ABTS 的初始濃度（CABTS-i）對 ABTS氧化產(chǎn)物最高生成濃度（CP-h）和ABTS最高轉(zhuǎn)化率（Rh）的影響見表1。

表1 Clac和 CABTS-i對CP-h和Rh的影響Table 1 Effects of Clacand CABTS-ion CP-hand Rh

由表1可知，Clac對Rh無影響；但是當(dāng)CABTS-i增加時，CP-h逐漸增加，但增幅逐漸變小，Rh逐漸減小。漆酶催化氧化作用符合乒乓機(jī)制[14-17]，圖2和表1結(jié)果顯示，ABTS氧化產(chǎn)物升高至一定程度時會抑制該催化氧化反應(yīng)的進(jìn)行，因此，ABTS無法全部被催化氧化；而溶氧被還原并與氫離子結(jié)合形成的水分子不會反映抑制反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)ABTS濃度足夠大，反應(yīng)時間足夠長時，溶氧會全部被還原形成水分子。

在漆酶活性檢測過程中，當(dāng)ABTS和溶氧濃度均足夠大時，曲線斜率最大并保持不變[18]，此時的催化反應(yīng)速率是初始催化反應(yīng)速率，可以代表漆酶的催化能力，體現(xiàn)了該酶分子的特性，這樣的檢測結(jié)果重現(xiàn)性好，使不同來源、不同酶學(xué)性質(zhì)、不同純度的漆酶及其酶制劑的酶活性數(shù)據(jù)更具可比性。隨著催化反應(yīng)的進(jìn)行，任何一種底物無論ABTS還是溶氧降低到一定濃度，均會降低催化反應(yīng)速率，因而此時ABTS與溶氧的消耗速率均無法真正反映漆酶的催化能力[13]。溶氧的濃度直接影響漆酶的催化反應(yīng)速率[19]，在測定漆酶活性的實(shí)踐中，通常不再通過攪拌或通入氧氣等手段提高反應(yīng)體系的溶氧濃度，而是采取降低酶濃度的方式使之與溶氧和ABTS的濃度相匹配，檢測漆酶的初始催化反應(yīng)速率。為此，考察了不同酶濃度的酶活性檢測體系中溶氧濃度及ABTS濃度隨檢測時間的變化規(guī)律，結(jié)果見圖3；同時通過圖3得到了酶濃度（Clac）對初始催化反應(yīng)速率（VO2-i和VABTS-i）、使漆酶保持初始催化反應(yīng)速率的ABTS的最低濃度（CABTS-l）或溶氧的最低濃度（CO2-l）以及使漆酶保持初始催化反應(yīng)速率的最長檢測時間（T）的影響，結(jié)果見表2和表3。

圖3 檢測體系中不同漆酶濃度對溶氧濃度及ABTS濃度隨檢測時間變化的影響Fig.3 Influences of different laccase concentrations in the detection system on the changes of DO concentration and ABTS concentration with the test time

表2 Clac對 VO2-i、CO2-l和 T 的影響Table 2 Experimentally observed VO2-i，CO2-l，and T for different Clac

表3 Clac對 VABTS-i、CABTS-l和 T 的影響Table 3 Experimentally observed VABTS-i，CABTS-land T for different Clac

通過比較圖3a和圖3b發(fā)現(xiàn)，溶氧濃度的變化趨勢與ABTS相似，即隨著酶濃度的增加，初始曲線斜率增大，代表初始催化反應(yīng)速率升高，而且初始催化反應(yīng)速率與酶濃度呈正比關(guān)系（表2和表3），進(jìn)一步證實(shí)了準(zhǔn)確測定初始催化反應(yīng)速率對于酶活性定量測定的重要性。使漆酶保持初始催化反應(yīng)速率時ABTS的最低濃度（CABTS-l）和溶氧的最低濃度（CO2-l）是漆酶活性檢測的關(guān)鍵參數(shù)，隨著酶濃度（Clac）的增加，CABTS-l和CO2-l逐漸增大（表2和表3），這是由于酶濃度越高，使酶飽和所需要的溶氧濃度和ABTS濃度越高。由圖3a和圖3b可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)ABTS濃度低于CABTS-l或溶氧低于CO2-l，曲線斜率開始變小，催化反應(yīng)速率下降。因此，在酶活性測定過程中，溶氧及ABTS濃度均不應(yīng)低于使漆酶保持初始催化反應(yīng)速率時所要求的最低濃度。

通過表2和表3還發(fā)現(xiàn)，隨著酶濃度的增加，T逐漸減小，在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)Clac增加至0.062 5n，T僅為9 s。當(dāng)檢測時間大于T時，得到檢測結(jié)果就不是酶的初始催化反應(yīng)速率。該結(jié)果進(jìn)一步說明：現(xiàn)有的“兩點(diǎn)法”測定漆酶活性（ABTS法），多規(guī)定反應(yīng)的兩個檢測時間點(diǎn)之間的檢測時長為3 min，得到的結(jié)果或許并非初始催化反應(yīng)速率。

本研究通過在恒溫反應(yīng)過程中實(shí)時測定吸光度，可以連續(xù)得到多個產(chǎn)物或ABTS的濃度，如果發(fā)現(xiàn)ABTS濃度已降低至CABTS-l以下，則可截取曲線前段的直線部分的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，從而避免由于溶氧或ABTS濃度降低而引起的誤差。

2.2 溫度的控制

利用恒溫反應(yīng)分光光度系統(tǒng)測定漆酶活性，反應(yīng)體系經(jīng)混合均勻才開始測定吸光度，因此，我們從理論上預(yù)期，在漆酶活性測定的前期，ABTS和溶氧濃度相對酶的濃度足夠大，催化反應(yīng)速率保持最大，曲線的斜率不會發(fā)生變化（如圖1的A和B點(diǎn)之間），即ABTS氧化產(chǎn)物生成量與檢測時間呈線性關(guān)系。但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在420 nm處測定的代表產(chǎn)物生成量的吸光度隨檢測時間變化（圖4）的斜率是變化的，與預(yù)期的直線不同。

圖4 未經(jīng)預(yù)熱的漆酶活性檢測體系的吸光度變化Fig.4 Absorbance changes of laccase activity detection system without preheat

由圖4可以看出，反應(yīng)初期的曲線斜率呈逐漸增大趨勢，在68 s以后斜率穩(wěn)定。這可能是由于酶催化反應(yīng)的試液、待測酶液的溫度是室溫，而酶催化反應(yīng)的設(shè)定溫度為55℃。將上述室溫的液體在比色皿中混合均勻即放入水浴恒溫比色皿架開始吸光度的測定，吸光度測定開始后反應(yīng)體系的溫度逐漸上升，在68 s以后達(dá)到設(shè)定溫度，是反應(yīng)體系的溫度影響了催化反應(yīng)速率。

為驗(yàn)證該設(shè)想，研究了當(dāng)Clac為0.025 000n時，酶活性測定所用試液未經(jīng)預(yù)熱，不同催化反應(yīng)溫度反應(yīng)體系的吸光度值隨檢測時間的變化，結(jié)果見圖5a，并將所用試液預(yù)熱后重新測定的不同催化反應(yīng)溫度反應(yīng)體系的吸光度值隨時間的變化結(jié)果見圖5b。

圖5 不同溫度有無預(yù)熱漆酶活性檢測體系的吸光度變化Fig.5 Absorbance changes of laccase activity detection system with and without preheat at different temperatures

由圖5a可知，在酶活性測定所用試液未經(jīng)預(yù)熱的情況下，隨著設(shè)定溫度的提高，曲線斜率達(dá)到穩(wěn)定值所需要的時間延長，即設(shè)定溫度與室溫差距越大，體系達(dá)到設(shè)定溫度所需的時間越長。我們將酶活性測定所用的試液和待測酶液置于與催化反應(yīng)溫度相同的水浴中進(jìn)行充分預(yù)熱，使其溫度達(dá)到酶活性檢測的設(shè)定溫度。重新測定的不同催化反應(yīng)溫度反應(yīng)體系的吸光度值隨時間的變化結(jié)果見圖5b。由圖5b可知，曲線均為一條斜率幾乎無變化的直線（R2≥0.999 9）。這一結(jié)果再次證明了溫度對酶活性測定的影響。

2.3 檢測時長的縮短

多數(shù)文獻(xiàn)將測定漆酶活性所用的“兩點(diǎn)法”的檢測時長定為180 s或更長[11，20-21]。由于在初始催化反應(yīng)階段產(chǎn)物的生成量與時間呈線性關(guān)系，只需任意截取其中的一段直線，即可計(jì)算得到基于初始催化反應(yīng)速率的酶活性。因而設(shè)想是否可以僅用兩個相鄰的吸光度檢測點(diǎn)的吸光度值來計(jì)算酶活性，從而大幅度縮短酶活性的檢測時長。

為此，在相同的反應(yīng)條件下開展了不同檢測時長的多組試驗(yàn)，每組3個平行，各組試驗(yàn)酶活性測定結(jié)果的平均值見表4。

表4 不同檢測時長對酶活性測定結(jié)果的影響Table 4 Effect of test duration on the detection results of laccase activity

本試驗(yàn)的檢測系統(tǒng)讀取吸光度值的最小時間間隔為1 s。由表4可知，即使將檢測時長縮短至1 s（吸光度值的讀取時間點(diǎn)可以是第0 s和第1 s），酶活性的測定值與檢測時長為180 s的測定值無差異，檢測時長的縮短對測定結(jié)果無影響。這不僅顯著提高測定效率，而且這樣短的檢測時長更能使酶保持初始催化反應(yīng)速率，進(jìn)一步避免了酶濃度和底物濃度給檢測結(jié)果帶來的影響。

3 結(jié)論

以恒溫反應(yīng)分光光度系統(tǒng)測定漆酶活性，酶的恒溫催化反應(yīng)與吸光度的實(shí)時檢測在同一時空進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了檢測過程中酶催化反應(yīng)溫度的精確控制及催化反應(yīng)時長的精確計(jì)量，大幅度降低因計(jì)量而引起的誤差。而且，由于可以在酶恒溫催化反應(yīng)的同時實(shí)時監(jiān)測產(chǎn)物或底物濃度及催化反應(yīng)速率的變化，一方面，可以避免反應(yīng)過程中因ABTS和溶氧的消耗而引起測定結(jié)果的誤差，確保通過初始催化反應(yīng)速率計(jì)算酶活性，測定結(jié)果準(zhǔn)確。另一方面，由于初始催化反應(yīng)速率是酶的特征指標(biāo)，因而重現(xiàn)性好，更便于不同漆酶及其制劑酶活力的比較。在此基礎(chǔ)上，本研究建立的“三點(diǎn)法”，不僅顯著縮短了檢測時長，而且大幅度降低了ABTS和待測酶液的濃度，節(jié)省試劑成本。由于該方法不需要在催化反應(yīng)后進(jìn)行終止反應(yīng)的操作，簡化了操作程序，進(jìn)一步縮短了檢測全過程消耗的總時長。