基于超聲法通透化處理提高靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙氨酸合成苯乳酸產(chǎn)量

侯穎，劉洋，王浩源，劉楊韜，孫宇婷，張榮飛，周中凱，張守慶，譚之磊，賈士儒*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津天隆農(nóng)業(yè)科技有限公司，天津 300457；3.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；4.中科藍(lán)海測(cè)試（天津）科技有限公司，天津 300457）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）被認(rèn)為是一種有效的抗菌化合物，對(duì)細(xì)菌和真菌具有廣譜抑菌作用，因此被用作抗菌劑、食品防腐劑和風(fēng)味化合物[1]。PLA的生物合成方法主要包括微生物發(fā)酵和酶促/靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化。多種乳酸菌均具有PLA合成能力，Lactobacillus plantarum AB-1、Lactobacillus plantarum UN-30 和 Lactobacillus plantarum BLPC002在Man-Rogosa-Sharpe（MRS）培養(yǎng)基中發(fā)酵，PLA產(chǎn)量分別達(dá)到（252.44±2.63）mg/L[2]、2 930 mg/L[3]和 1.67 g/L[4]。 但是由于代謝路線較長(zhǎng)，關(guān)鍵酶活性低，發(fā)酵法產(chǎn)量較低，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

與純酶催化法相比，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法具有無需進(jìn)行酶的純化、酶穩(wěn)定性高、細(xì)胞可重復(fù)使用、產(chǎn)品易于分離等優(yōu)點(diǎn)[5]。然而，靜息細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)阻礙了細(xì)胞催化劑的快速反應(yīng)。如，大腸桿菌的細(xì)胞膜分為外膜和內(nèi)膜，外膜約為6.7 μm2，含有3.5×106個(gè)脂多糖分子，占據(jù)細(xì)菌表面的四分之三，密集組裝的脂多糖是底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)的重要屏障[6]，導(dǎo)致游離酶催化比細(xì)胞催化速率高10倍～100倍。因此，必須制備通透性提高的靜息細(xì)胞，以增加細(xì)胞膜的通透性，降低細(xì)胞的屏障效應(yīng)及傳質(zhì)阻力，在保持細(xì)胞活性的同時(shí)提高催化反應(yīng)速率。

超聲波是頻率大于20 kHz的聲波，具有波動(dòng)和能量的雙重特性。低頻超聲一般在20 kHz～50 kHz之間，高頻超聲一般大于50 kHz[7]。在生物領(lǐng)域，高頻高強(qiáng)度超聲一般會(huì)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的不可逆破壞，用于細(xì)胞破碎等高強(qiáng)度處理過程；而低頻低強(qiáng)度超聲借助超聲波的傳輸引起細(xì)胞膜和細(xì)胞壁附近介質(zhì)的振動(dòng)，因此會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成輕微可逆性改變，可用于增強(qiáng)酶活性、代謝效率、細(xì)胞傳質(zhì)效率。有研究表明用20 kHz低頻率超聲處理使酵母細(xì)胞生長(zhǎng)停滯期減少1 h[7]。Ewe等[8-9]對(duì)豆?jié){中的乳酸桿菌屬進(jìn)行超聲處理（30 kHz、100 W），促進(jìn)了乳酸桿菌的生長(zhǎng)，β-葡萄糖苷酶活性提高了10% 。

前期研究中，我們構(gòu)建了共表達(dá)L-氨基酸脫氨酶（L-amino acid deaminase，L-AAD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）的重組 Escherichia coli靜息細(xì)胞，催化底物苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）生成中間體苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA），然后最終合成PLA。通過定向進(jìn)化和定點(diǎn)突變結(jié)合高通量篩選，得到了底物結(jié)合能力和催化效率顯著提高的Proteus mirabilis來源的L-AAD突變體[10]；通過共線性分析及系統(tǒng)生物學(xué)的方法對(duì)LDH進(jìn)行篩選，確定Lactobacillus CGMCC 9967來源的乳酸脫氫酶為最佳LDH[11]；通過消除PPA降解副反應(yīng)，敲除E.coli胞內(nèi)存在的3種催化PPA降解的轉(zhuǎn)氨酶[12]，輔酶合成和再生途徑改造[13]，及在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)節(jié)3種酶的表達(dá)量，PLA產(chǎn)量提高至43.8 g/L，這是現(xiàn)有報(bào)道中靜息細(xì)胞催化合成PLA的較高產(chǎn)量[14]。但是難以進(jìn)一步提高PLA產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，距離工業(yè)化仍有很大差距。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，LDH和FDH均位于細(xì)胞質(zhì)中[15-16]。根據(jù)預(yù)測(cè)軟件 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0），P.mirabilis來源的 L-AAD是一種II型單次跨膜蛋白，氨基酸殘基1-6位于胞質(zhì)，殘基7-29形成單跨膜螺旋穿過細(xì)胞膜，殘基30-471位于胞外。此外Hossain等[17]為了確定L-AAD的C末端還是N末端位于細(xì)胞膜外側(cè)，分別構(gòu)建了含有外側(cè)向外和內(nèi)側(cè)向外囊泡的重組靜息細(xì)胞催化劑，發(fā)現(xiàn)只有外側(cè)向外囊泡的重組靜息細(xì)胞具有脫氨酶活性，這一結(jié)果初步證明了軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的正確性。因此推測(cè)，靜息細(xì)胞催化過程中底物PHE、中間體PPA和產(chǎn)物PLA 3種物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程：在細(xì)胞外，膜蛋白酶L-AAD催化底物PHE合成中間體PPA，PPA在膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)；在細(xì)胞內(nèi)，LDH和FDH催化PPA合成PLA；胞內(nèi)的PLA在膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。底物和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)可能是影響靜息細(xì)胞催化的限制性因素，難以進(jìn)一步提高PLA產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率。

為了提高底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)速率，本研究首先對(duì)超聲破碎條件進(jìn)行優(yōu)化，得到細(xì)胞通透能力顯著提高的靜息細(xì)胞，然后對(duì)靜息細(xì)胞催化條件進(jìn)行優(yōu)化，最后研究催化過程中胞內(nèi)PHE、PPA和PLA濃度變化，確定超聲對(duì)底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)速率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

前期研究中構(gòu)建的重組E.coli BL21（pRSFDuet-2ldh-rbs2aad-fdh）作為靜息細(xì)胞催化劑[18]。胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂：賽默飛世爾科技公司；氯化鈉（分析級(jí)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L， 卡那霉素 100 μg/mL，pH7.4，121 ℃滅菌 20 min；TB（Terrific Broth）培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）100 mmol/L， 無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇1% （體積分?jǐn)?shù)），pH7.4，121 ℃滅菌 20 min；PBS 緩沖液：NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.44 g/L，KH2PO40.24 g/L，pH7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

JY88-IIN超聲破碎儀（總功率為1 000 W）：中國(guó)新芝公司；TZ9S紫外可見分光光度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DNP-9162微生物恒溫培養(yǎng)箱：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)：日本Hitachi公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 靜息細(xì)胞催化劑制備

從甘油管中吸取少量菌液置于LB搖菌管中，37℃，220 r/min的條件下培養(yǎng)10 h，以1% （體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種于100 mL TB培養(yǎng)基（含100 μg/mL卡那霉素），37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5左右，添加誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 至終濃度為 0.04 mmol/L，于 20℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá) 10 h～12 h。 8 000 r/min、4℃離心10 min并棄掉上清液。用PBS緩沖液對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行洗滌和重懸，8 000 r/min離心10 min棄掉上清液。根據(jù)具體試驗(yàn)需求重懸并調(diào)整OD600。

1.3.2 超聲通透化處理優(yōu)化

選擇操作頻率為20 kHz～25 kHz的超聲破碎儀對(duì)培養(yǎng)好的靜息細(xì)胞催化劑進(jìn)行超聲處理。所有超聲試驗(yàn)均保證使用Φ6的超聲探頭深入到PBS靜息細(xì)胞催化劑中懸液液面以下3 cm處。為防止超聲時(shí)產(chǎn)生的熱量破壞細(xì)胞催化劑，超聲試驗(yàn)在冰盒中進(jìn)行。

超聲通透化處理過程中主要影響因素有超聲波功率、處理時(shí)間和占空比等。為了得到最佳的超聲處理?xiàng)l件，以超聲波功率（1% 、10% 、20% 、30% 、40% ）、處理時(shí)間（30、60、120 s）和占空比（50% 、60% 、70% 、80% 、90% ）作為考察因素，以苯乳酸濃度作為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞催化條件優(yōu)化

在超聲通透化處理?xiàng)l件得到優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以溫度（25、30、35、40、45 ℃）、pH 值（5、6、7、8、9）、緩沖液種類（PBS、生理鹽水、水）為考察因素，同樣以苯乳酸產(chǎn)量作為試驗(yàn)指標(biāo)，逐步減小試驗(yàn)梯度，進(jìn)行細(xì)胞催化條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞蛋白及核酸透性檢測(cè)

細(xì)胞核酸增強(qiáng)率（R1）按式（1）計(jì)算。

式中：a為260 nm波長(zhǎng)下未超聲波處理的細(xì)胞懸液上清液的吸光值；b為260 nm波長(zhǎng)下超聲處理后的細(xì)胞懸液上清液的吸光值。

細(xì)胞蛋白增強(qiáng)率（R2）按式（2）計(jì)算。

式中：c為280 nm波長(zhǎng)下未超聲波處理的細(xì)胞懸液上清液的吸光值；d為280 nm波長(zhǎng)下超聲處理后的細(xì)胞懸液上清液的吸光值。

1.3.5 PHE、PPA和PLA的檢測(cè)方法

參考Valerio等[19]的方法，適當(dāng)修改。HPLC條件：選用安捷倫反相色譜柱ZORBOX SB-C18，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相為水（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序?yàn)?0～20 min由10% B線性變化至100% ，20 min～23 min保持 100% B，23 min～25 min由 100% B 線性變化至10% 。流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用PASW Statistics 18、Origin和Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲通透化處理?xiàng)l件優(yōu)化

超聲通透化處理占空比、功率對(duì)PLA濃度的影響如圖1所示。

圖1 占空比、功率對(duì)PLA濃度的影響

設(shè)定處理時(shí)間為1 min，未超聲處理對(duì)照組PLA濃度為12.96 g/L，首先對(duì)超聲通透化占空比和功率進(jìn)行優(yōu)化。由圖1可知，當(dāng)占空比為80% 時(shí)，PLA濃度普遍高于其他的占空比的組別。當(dāng)功率為30% ，占空比為80% 時(shí)PLA濃度最高，為20.65 g/L，是占空比60% 、70% 和90% 的1.96倍、1.61倍和1.47倍，比對(duì)照組提高了37.53% 。當(dāng)占空比低到60% 時(shí)，PLA濃度低于對(duì)照組。

由于功率和占空比對(duì)于細(xì)胞通透性的重要性，基于上述優(yōu)化的初步結(jié)果，將超聲功率范圍縮小到30% 附近，占空比范圍縮小到80% 附近進(jìn)一步優(yōu)化這兩個(gè)條件。結(jié)果見圖2。

圖2 功率和占空比對(duì)PLA濃度的影響Fig.2 Effect of power and duty cycle on PLA concentration

如圖2所示，占空比為80% 時(shí)，功率30% PLA濃度是功率25% 和35% 的1.1倍和1.08倍。功率為30% 時(shí)，占空比80% PLA濃度是占空比70% 和90% 的1.09倍和1.1倍。

同時(shí)改變功率和超聲時(shí)間對(duì)PLA濃度的影響如圖3所示。

圖3 功率和時(shí)間對(duì)PLA濃度的影響Fig.3 Effect of power and time on PLA concentration

由圖3可知，功率為30% ，超聲時(shí)間為1 min時(shí)PLA濃度相較于功率為29% 和31% 分別提高9.5% 和9.1% 。且超聲處理時(shí)間越長(zhǎng)PLA濃度越低，功率為30% 時(shí)延長(zhǎng)處理時(shí)間至2 min和3 min時(shí)PLA濃度是超聲1 min的93.2% 和91.6% 。因此，超聲通透化處理最佳條件為處理時(shí)間1 min、占空比80% 、功率30% 。在此最優(yōu)條件下，PHE初始濃度為30 g/L，PLA濃度達(dá)到20.65 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為68.4% ，是未超聲處理的1.59倍。

2.2 通透化細(xì)胞催化條件優(yōu)化

通過超聲通透化處理后，靜息細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其催化條件也可能發(fā)生改變。因此以未超聲處理為對(duì)照組，對(duì)催化條件（pH值、溫度、緩沖液）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 pH值對(duì)PLA濃度的影響Fig.4 Effect of pH value on PLA concentration

圖5 溫度對(duì)PLA濃度的影響Fig.5 Effect of temperature on PLA concentration

圖6 緩沖液對(duì)PLA濃度的影響Fig.6 Effect of buffer on PLA concentration

由圖4可知，不同pH值下經(jīng)最優(yōu)超聲條件處理的試驗(yàn)組PLA濃度均高于相應(yīng)對(duì)照組，且在pH7時(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組PLA濃度達(dá)到最大，分別為52.59 g/L和43.93 g/L。以試驗(yàn)組為例，隨著pH值提高，PLA濃度先升高后降低，pH7時(shí)PLA濃度達(dá)到最高，是pH6時(shí)的1.09倍。進(jìn)一步提高pH值為9時(shí)，PLA濃度降低為最高濃度的87.3% 。結(jié)果表明，試驗(yàn)組和對(duì)照組在不同pH值條件下PLA濃度變化趨勢(shì)相同，且超聲通透作用并未改變通透化靜息細(xì)胞的較佳pH值，其較適pH值為7。

如圖5所示，試驗(yàn)組和對(duì)照組PLA濃度隨溫度變化趨勢(shì)相同，且不同溫度下超聲處理的試驗(yàn)組PLA濃度均高于相應(yīng)對(duì)照組。隨著催化溫度提高，PLA濃度先升高后降低，35℃時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組PLA濃度達(dá)到最高，試驗(yàn)組PLA濃度（52.59 g/L）是對(duì)照組（43.93 g/L）的1.2倍；試驗(yàn)組和對(duì)照組35℃時(shí)PLA濃度是30℃時(shí)的1.16倍和1.25倍。隨著催化溫度進(jìn)一步提高，PLA濃度降低，40℃時(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組PLA濃度比35℃分別降低4.9% 和9.1% 。結(jié)果表明，超聲通透作用并未改變通透化靜息細(xì)胞的最適溫度，較適溫度為35℃。

如圖6所示，使用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞并作為超聲組催化緩沖液時(shí)PLA濃度最高，是使用生理鹽水和蒸餾水時(shí)PLA濃度的1.28倍和1.49倍。說明緩沖液類型也會(huì)影響靜息細(xì)胞催化狀態(tài)。因此PBS是最合適的靜息細(xì)胞洗滌和催化緩沖液。

綜上，最優(yōu)通透化細(xì)胞操作和催化條件：在PBS緩沖液（pH7，35℃）中洗滌并重懸細(xì)胞，然后加入底物，在pH7，35℃下催化。在最佳催化條件下，PLA濃度從43.93 g/L提高到52.59 g/L，是原來的1.2倍，底物轉(zhuǎn)化率從78.70% 提高到94.59% 。

2.3 超聲處理對(duì)靜息細(xì)胞底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)速率的影響

根據(jù)超聲處理對(duì)PLA濃度和底物轉(zhuǎn)化率的影響，推斷超聲處理影響了靜息細(xì)胞底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)速率。為了驗(yàn)證推斷，檢測(cè)催化過程中3種物質(zhì)在胞內(nèi)胞外的濃度變化情況并分別進(jìn)行比較。以未超聲處理為對(duì)照組，以最優(yōu)超聲條件處理為試驗(yàn)組，在相同最優(yōu)靜息細(xì)胞催化條件下進(jìn)行催化，結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 靜息細(xì)胞催化過程中胞外PHE、PPA和PLA濃度變化Fig.7 Changes in the concentrations of extracellular PHE，PPA and PLA

圖8 靜息細(xì)胞催化過程中胞內(nèi)PHE、PPA和PLA濃度變化Fig.8 Changes in the concentrations of intracellular PHE，PPA and PLA

如圖7所示，胞外PHE初始濃度為60 g/L，0～8 h，PHE濃度迅速降低，此期間試驗(yàn)組胞外的PHE濃度一直低于對(duì)照組，6 h時(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組胞外的PHE濃度差距最大，6 h時(shí)試驗(yàn)組胞外的PHE濃度是對(duì)照組的56.8% ，說明超聲處理提高了胞外PHE的消耗速率。如圖8所示，0～8 h期間試驗(yàn)組胞內(nèi)的PHE濃度一直低于對(duì)照組，6 h時(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組胞內(nèi)的PHE濃度差距最大，6 h時(shí)試驗(yàn)組胞內(nèi)的PHE濃度是對(duì)照組的58.9% 。結(jié)合胞內(nèi)外PHE濃度變化趨勢(shì)結(jié)果，又由于低頻超聲對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響可能性不大，說明超聲處理提高了底物PHE由胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。

如圖7所示，0～8 h，PPA濃度升高較快，此期間試驗(yàn)組胞外的PPA濃度一直低于對(duì)照組，12 h時(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組胞外的PPA濃度差距最大，12 h時(shí)試驗(yàn)組胞外的PPA濃度是對(duì)照組的40% 。如圖8所示，隨時(shí)間延長(zhǎng)胞內(nèi)PPA濃度逐漸提高，催化前期0～8 h內(nèi)，試驗(yàn)組和對(duì)照組胞內(nèi)PPA濃度基本相同，可能是由于催化前期L-AAD氧化脫氨基反應(yīng)速率是反應(yīng)限制性因素，胞外積累的PPA濃度較低，向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的PPA較低，因此試驗(yàn)組和對(duì)照組PPA濃度差距不大。10h～14h，試驗(yàn)組胞內(nèi)PPA濃度明顯高于對(duì)照組，12 h時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組胞內(nèi)的PPA濃度差距最大，12 h時(shí)試驗(yàn)組胞內(nèi)PPA濃度是對(duì)照組的1.29倍。結(jié)合胞內(nèi)外PPA濃度變化趨勢(shì)結(jié)果，說明超聲處理提高了中間體PPA由胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。

如圖7所示，0～8 h，PLA濃度迅速提高，14 h時(shí)，對(duì)照組PLA濃度達(dá)到最高，為43.93 g/L；12 h時(shí)，試驗(yàn)組PLA濃度達(dá)到最高，為52.59 g/L。6 h時(shí)，對(duì)照組和試驗(yàn)組PLA濃度差距最大，試驗(yàn)組PLA濃度是對(duì)照組的1.49倍。如圖8所示，0～8 h，對(duì)照組和試驗(yàn)組胞內(nèi)PLA濃度差距不大，可能是由于催化前期LDH反應(yīng)速率是反應(yīng)限制性因素，胞內(nèi)積累的PLA濃度較低，向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的PLA較低，因此試驗(yàn)組和對(duì)照組PLA濃度差距不大。結(jié)合胞內(nèi)外PLA濃度變化趨勢(shì)結(jié)果，說明超聲處理提高了終產(chǎn)物PLA由胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。

為了進(jìn)一步研究細(xì)胞通透化處理對(duì)細(xì)胞的影響及量化細(xì)胞通透化的程度，進(jìn)行了催化過程中細(xì)胞蛋白及核酸透性檢測(cè)，結(jié)果見圖9、圖10。

圖9 細(xì)胞蛋白質(zhì)通透性（R1）檢測(cè)Fig.9 Detection of cellular protein acid permeability（R1）

圖10 細(xì)胞核酸通透性（R2）檢測(cè)Fig.10 Detection of cellular nucleic acid permeability（R2）

如圖9和圖10所示，靜息細(xì)胞超聲通透化處理后，R1和R2分別為19.48% 和19.69% 。在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，隨著催化時(shí)間的延長(zhǎng)，R1和R2逐漸提高，10 h時(shí)R1達(dá)到最大值，是催化初始時(shí)的1.87倍；12 h時(shí)R2達(dá)到最大值，是催化初始時(shí)的1.84倍。說明超聲處理提高了細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，催化過程中機(jī)械攪拌等作用也會(huì)加劇細(xì)胞通透性。0～4 h，R1和R2從初始19% 左右迅速提高到30% 以上，4 h～12 h R1和R2的增加速率明顯放緩，分別從30.26% 和32.46% 提高到35.16% 和36.23% 。這說明細(xì)胞膜通透性不會(huì)無限增加，可能是由于細(xì)胞自身具有某種修復(fù)機(jī)制，可以控制細(xì)胞通透程度，Avhad等[20]利用超聲處理球形芽孢桿菌MTCC 3672增加了細(xì)胞滲透性，改善了底物攝入并促進(jìn)了微生物細(xì)胞的新陳代謝，進(jìn)而促進(jìn)纖溶酶的合成，這與本研究結(jié)果類似。然而，利用掃描電子顯微鏡觀察發(fā)酵后期菌體結(jié)構(gòu)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)菌體表面出現(xiàn)大面積的孔洞與間隙，研究人員認(rèn)為這與細(xì)胞膜自我修復(fù)機(jī)制有關(guān)。這說明合理適當(dāng)程度的超聲通透化處理使靜息細(xì)胞細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆的孔洞和間隙，這些“通道”的存在使細(xì)胞膜通透性提高。但是細(xì)胞膜具有自我修復(fù)的能力，細(xì)胞膜膜通透性不會(huì)一直提高，細(xì)胞不會(huì)一直向外泄露蛋白質(zhì)和核酸。

3 討論與結(jié)論

超聲處理在強(qiáng)化生物技術(shù)過程（包括發(fā)酵、提取、生物催化和廢物處理）方面具有巨大潛力，Behzadnia等[21]發(fā)現(xiàn)超聲處理（25 kHz）能將植物乳桿菌ATCC 8014生產(chǎn)生物表面活性劑產(chǎn)量提高30% 。Dong等[22]發(fā)現(xiàn)超聲處理60 min能將重組大腸桿菌生產(chǎn)D-酒石酸的轉(zhuǎn)化效率提高兩倍。Huang等[23]發(fā)現(xiàn)超聲[（28±2）kHz]處理60 min能使熱帶假絲酵母的膜滲透性和細(xì)胞生長(zhǎng)率提高142.5% 。Sun等[24]發(fā)現(xiàn)超聲處理（40 kHz）可以強(qiáng)化真菌細(xì)胞生物量，使得竹紅菌甲素產(chǎn)量提高77.2% ?？傊?，超聲波對(duì)微生物代謝的有利影響包括：（1）消除微生物細(xì)胞團(tuán)，提高微生物的表面積/體積比，進(jìn)而提高胞內(nèi)外物質(zhì)交換；（2）增加細(xì)胞膜的滲透性，從而提高通過細(xì)胞膜的營(yíng)養(yǎng)吸收，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖；（3）改變微生物酶表面結(jié)構(gòu)，提高酶催化能力[25]。

超聲處理效果受到多種不同因素影響。其中，革蘭氏染色性質(zhì)在超聲處理效果中起著重要作用。一般革蘭氏陽性菌由于具有由磷壁酸和肽聚糖組成的更堅(jiān)固的細(xì)胞壁，比革蘭氏陰性菌更能抵抗超聲波。此外，細(xì)菌的形狀也會(huì)影響超聲處理效果。長(zhǎng)桿狀的桿型菌由于具有更大的表面積/體積，比球型菌更容易受到超聲波的影響。因此，大腸桿菌作為一種桿狀的革蘭氏陽性菌，是進(jìn)行超聲處理的很好選擇。

正確使用超聲參數(shù)，如超聲功率、占空比和超聲時(shí)間，對(duì)控制其催化能力至關(guān)重要。盲目增加超聲功率和時(shí)間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)擴(kuò)散，局部加熱，產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致細(xì)胞失活或死亡。因此應(yīng)在超聲處理產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上的改變并維持靜息細(xì)胞催化能力兩者之間找到平衡。

本研究使用超聲破碎儀對(duì)靜息細(xì)胞進(jìn)行通透化處理，優(yōu)化得到最佳超聲處理?xiàng)l件：處理時(shí)間1 min、占空比80% 、功率30% ；對(duì)通透化細(xì)胞催化條件進(jìn)行優(yōu)化，得到較佳催化條件：pH7、35℃、緩沖液為PBS。此條件下最終PLA的濃度從43.93 g/L提高到52.59 g/L，底物轉(zhuǎn)化率從78.7% 提高到94.59% 。最后，研究發(fā)現(xiàn)超聲處理可以提高PHE、PPA和PLA 3種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率，從而提高整個(gè)反應(yīng)的催化效率。