鏈格孢菌侵染采后伽師瓜抗病關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律

曾禹?？?，白羽嘉*，王乾乾，迪娜拉·海拉提，蔣莉瑩，劉陽，馮作山*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆果品采后科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052）

伽師瓜是新疆特有的一種成熟期較晚的厚皮甜瓜品種，是西北地區(qū)經(jīng)濟(jì)效益較好的一種農(nóng)作物[1]。伽師瓜果皮呈現(xiàn)深綠色并覆蓋有大網(wǎng)紋及小網(wǎng)紋，部分無網(wǎng)紋，果肉呈現(xiàn)橘紅色且肉質(zhì)松脆，口味清甜。伽師瓜的主要病害是由鏈格孢菌侵染采后伽師瓜所引起的黑斑病[2-3]。鏈格孢菌侵染伽師瓜果實(shí)后，侵染初期果實(shí)呈現(xiàn)水漬狀濕腐，伽師瓜表面果皮變軟并開始腐爛，后因鏈格孢菌開始產(chǎn)生分生孢子梗以及大量孢子，故而果實(shí)表面會形成黑色霉斑[4-7]。在病原菌開始侵染果實(shí)時，植物細(xì)胞會刺激產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHT）及 β-1，3 葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）以降解構(gòu)成真菌細(xì)胞壁骨架的幾丁質(zhì)與纖維素，從而影響真菌微生物的形態(tài)形成、生理活性和生長發(fā)育等，達(dá)到抵抗病原微生物入侵的目的[8-11]。病原微生物侵染同樣會激活植物體內(nèi)的苯丙烷代謝過程，苯丙烷代謝是植物抵抗病原菌侵染的另一途徑，通過此途徑可產(chǎn)生一類抗病原物的化合物即類黃酮植保素及酚類物質(zhì)，后者進(jìn)一步氧化生成對病原菌有毒害作用的醌類物質(zhì)，從而達(dá)到抗病作用[12-13]。

目前，關(guān)于鏈格孢菌侵染采后甜瓜的研究，多采用損傷接種的方法，此方法使得病原菌更容易侵染到果實(shí)內(nèi)部，損傷接種的方法不但破壞了甜瓜果實(shí)的完整性，同時也破壞了果實(shí)抗病的第一道防線——外果皮，外果皮是果實(shí)重要的物理抗病性結(jié)構(gòu)[14]。本試驗(yàn)采用無損接菌的方法，模擬自然環(huán)境下甜瓜果實(shí)被侵染的情況，將鏈格孢菌孢子懸浮液吸附在伽師瓜外果皮自然產(chǎn)生的大、小、無網(wǎng)紋處，計算病害發(fā)生率，分析苯丙烷代謝相關(guān)酶活性的變化規(guī)律以及β-1，3葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性的變化規(guī)律，研究不同網(wǎng)紋組織、不同果實(shí)組織抗病能力的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

伽師瓜：采摘于新疆喀什地區(qū)伽師縣，果實(shí)質(zhì)量（4.0±0.5）kg、可溶性固形物含量（12.5±0.5）°Brix。

鏈格孢菌（Alternaria alternata）：對已自然發(fā)病的伽師瓜果實(shí)進(jìn)行鏈格孢菌的分離純化并使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基保存。

1.2 試劑

30% H2O2、3，5-二硝基水楊酸、丙酮、冰乙酸、結(jié)晶酚、酒石酸鉀鈉、L-抗壞血酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、無水乙酸鈉、五水合四硼酸鉀、亞硫酸鈉（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；二甲苯、中性樹膠（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；幾丁質(zhì)、昆布多糖（均為分析純）：美國西格瑪奧德里奇公司；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、脫鹽蝸牛酶、β-巰基乙醇、瓊脂糖：生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 儀器與設(shè)備

NBCJ-B型無菌操作臺、MHP-250型恒溫霉菌培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；XHF-DY型高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810PC型紫外-可見分光光度計：北京普析通用公司；DZKWS-4型電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 樣品制備

1.4.1.1 伽師瓜預(yù)處理

配備2% 雙氧水溶液用于伽師瓜果實(shí)表面的殺菌與清洗，重復(fù)操作3次后置于陰涼且通風(fēng)處晾干備用。

1.4.1.2 網(wǎng)紋分級

大、小、無網(wǎng)紋的分級規(guī)則：伽師瓜外果皮網(wǎng)紋處網(wǎng)紋縱橫比（mm）>20∶3 為大網(wǎng)紋組；10∶1≤伽師瓜外果皮網(wǎng)紋處網(wǎng)紋縱橫比（mm）≤20∶3為小網(wǎng)紋組；伽師瓜外果皮以接種點(diǎn)為中心，半徑20 mm內(nèi)無網(wǎng)紋為無網(wǎng)紋組。

1.4.1.3 病原菌侵染

制備濃度為1.0×106spores/mL[8](含0.01% 吐溫20)鏈格孢菌孢子懸浮液。

1.4.1.4 伽師瓜無損接種

接種組：取20 μL鏈格孢菌孢子懸浮液接種于無菌海綿布上并粘貼在伽師瓜外果皮處的大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋及無網(wǎng)紋處，各伽師瓜果實(shí)大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋、無網(wǎng)紋組均接種10個點(diǎn)后置于室溫貯藏。

對照組：取20 μL無菌水接種于無菌海綿布上并粘貼在伽師瓜外果皮處的大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋及無網(wǎng)紋處，各伽師瓜果實(shí)大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋、無網(wǎng)紋組均接種10個點(diǎn)后置于室溫貯藏。

1.4.1.5 取樣

1.4.2 指標(biāo)測定

1.4.2.1 病害發(fā)生率

對照組因接種無菌水、貯藏期間無病害，故不統(tǒng)計對照組病害發(fā)生率，接種組各網(wǎng)紋組接種點(diǎn)出現(xiàn)直徑≥4.0 mm的黑色病斑即病害發(fā)生，分別統(tǒng)計大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組和無網(wǎng)紋組的病害發(fā)生率。

1.4.2.2 失重率

接種組與對照組只區(qū)分是否接種病原菌并不區(qū)分網(wǎng)紋，測量時均測量完整果實(shí)，利用電子秤分別稱量貯藏前與貯藏后伽師瓜的質(zhì)量，計算失重率。

1.4.2.3 可溶性固形物含量

接種組與對照組只區(qū)分是否接種病原菌并不區(qū)分網(wǎng)紋，測量時均測量完整果實(shí)，隨機(jī)選擇6個伽師瓜取果肉榨汁，使用折光儀測量可溶性固形物含量。

1.4.2.4 硬度

給予綜合對癥治療：予阿托伐他汀鈣片20 mg，1次/d口服，以降血脂；予口服降糖藥或胰島素已控制血糖；根據(jù)具體病情，給予降血壓、改善腦部血液循環(huán)等治療；再予阿司匹林腸溶片100 mg，1次/d口服。治療3個月為1個療程，共1個療程。

接種組與對照組只區(qū)分是否接種病原菌并不區(qū)分網(wǎng)紋，測量時均測量完整果實(shí)，隨機(jī)選擇6個果實(shí)，使用硬度計測定硬度。

1.4.2.5 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活性的測定

PAL活性的測定方法參照文獻(xiàn)[15]。稱取0.3g外果皮、內(nèi)果皮1.5g、果肉2g，分別加入濃度為100 mmol/L、pH8.8的硼酸緩沖溶液5、5、4 mL。冰浴研磨后于4℃、12 000 r/min條件下離心30 min，上清液即粗酶液，低溫保存?zhèn)溆谩Ｈ∫恢г嚬芗尤? mL濃度為50 mmol/L、pH8.8的硼酸緩沖溶液，0.5 mL濃度為20 mmol/L的L-苯丙氨酸，30℃保溫10 min后加入0.5 mL酶提取液混勻，迅速測定290 nm波長下的吸光度記為OD0，將剩余混合液置于30℃下保溫60 min后再次測定290 nm波長下的吸光度值記為OD1，根據(jù)吸光度的變化量計算PAL活性。

1.4.2.6 4-香豆酰輔酶A連接酶（4-coumaroyl-Coa ligase，4CL）活性的測定

4CL活性的測定參照張培嶺等[12]的方法。稱取外果皮0.1 g、內(nèi)果皮0.5 g、果肉1 g，分別加入pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液5.9、5.5、5.0 mL。在冰浴研磨后，于4℃、12 000 r/min條件下離心20 min，上清液即粗酶提取液。取一支試管加入1 mL酶提取液、0.45 mL濃度為5 μmol/L 的 p-香豆酸、0.45 mL 濃度為 50 μmol/L 的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、0.45 mL濃度為1μmol/L的輔酶A、1.35mL濃度為15μmol/L的MgSO4?？瞻讓φ諡椴患觩-香豆酸，40℃下保溫10 min后立即在波長333 nm下測定吸光度。空白對照組記為OD0，試驗(yàn)組記為OD1，以吸光度變化量計算4CL活性。

1.4.2.7 幾丁質(zhì)酶（CHT）和β-1，3葡聚糖酶（GLU）活性的測定

CHT和GLU活性的測定方法參照文獻(xiàn)[15]。

CHT活性：稱取外果皮0.5g、內(nèi)果皮0.5g、果肉1g，分別加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（含EDTA、β-巰基乙醇）5.5、5.5、5.0 mL。在冰浴研磨后，于4℃、12 000 r/min條件下離心30 min，上清液即粗酶提取液。取一支試管加入1 mL酶提取液；0.5 mL濃度為50 mmol/L、pH5.2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液；0.5 mL濃度為10 g/L膠狀幾丁質(zhì)懸浮液。空白組只加入1.5 mL的蒸餾水，對照組加入的酶液為沸水浴滅活5 min后的酶液。37℃保溫1 h后，空白組、對照組、試驗(yàn)組均加入0.2 mL濃度為0.6 mol/L的四硼酸鉀。再經(jīng)沸水浴5 min后立即在波長585 nm下測定吸光度。對照組記為OD0，試驗(yàn)組記為OD1，通過吸光度差量查出標(biāo)準(zhǔn)曲線上相應(yīng)的N-乙酰葡萄糖胺微摩爾數(shù)，以每秒鐘每克樣品中酶解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol N-乙酰葡萄糖胺一個CHT活性單位（U）。

GLU活性：稱取外果皮0.1 g、內(nèi)果皮1 g、果肉2 g，分別加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（含EDTA、L-抗壞血酸、β-巰基乙醇）4.9、5.0、4.0mL。在冰浴研磨后，于4℃、12 000 r/min條件下離心30 min，上清液即粗酶提取液。取一支試管加入100 μL酶提取液、100 μL濃度為4 g/L的昆布多糖、1.8 mL的蒸餾水、1.5 mL的3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑；空白組不加昆布多糖以及酶液，蒸餾水為2 mL；對照組加入的酶液為沸水浴滅活5 min后的酶液。再經(jīng)沸水浴3 min后冷卻，加入蒸餾水定容至25 mL，混勻，立即在波長540 nm下測定吸光度。對照組記為OD0，試驗(yàn)組記為OD1，以吸光度變化量查出標(biāo)準(zhǔn)曲線上葡萄糖的毫克數(shù)，以每秒鐘每克樣品中酶解昆布多糖產(chǎn)生1×10-9mol葡萄糖為一個GLU活性單位（U）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析（p＜0.05，差異顯著），采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害發(fā)生率

采后伽師瓜經(jīng)鏈格孢菌無損接菌侵染后病害發(fā)生率見圖1。

圖1 病害發(fā)生率Fig.1 Disease incidence

如圖1所示，大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋以及無網(wǎng)紋處均有黑斑病的發(fā)生，且黑斑病發(fā)生率隨著貯藏時間的延長而增加，病害發(fā)生率總體呈現(xiàn)上升的趨勢。3種網(wǎng)紋均在3 d時開始出現(xiàn)病斑，且在接種18 d時達(dá)到最大，此時大網(wǎng)紋組病害發(fā)生率為89.00% ，小網(wǎng)紋病害發(fā)生率為83.33% ，無網(wǎng)紋病害發(fā)生率為78.00% ，差異顯著（p＜0.05）。推測是由于在伽師瓜生長過程中表皮會產(chǎn)生一種角質(zhì)膜，而這種角質(zhì)膜有一定的疏水性，對鏈格孢菌的孢子懸浮液起到了抵抗作用[16-17]。而大網(wǎng)紋以及小網(wǎng)紋在伽師瓜的生長過程中外表皮開裂后會形成木栓，導(dǎo)致疏水性較差且表皮網(wǎng)紋下陷，易被鏈格孢菌附著，病害發(fā)生率隨之升高[8]，與本研究結(jié)果相似。

2.2 鏈格孢菌侵染對伽師瓜果實(shí)失重率、硬度、可溶性固形物含量的影響

2.2.1 鏈格孢菌侵染對伽師瓜失重率的影響

鏈格孢菌侵染對伽師瓜失重率的影響見圖2。

圖2 鏈格孢菌侵染對伽師瓜失重率的影響Fig.2 Effect of Alternaria alternata infection on weight loss rate of Jiashi melon

如圖2所示，采后伽師瓜經(jīng)鏈格孢菌無損接菌侵染后，接種組與對照組伽師瓜果實(shí)失重率隨著貯藏時間的延長而增加，差異顯著（p＜0.05）。在貯藏期達(dá)到18 d時接種組與對照組失重率最大，此時接種組失重率為7.89% ，對照組失重率為7.09% 。推測接種組失重率高于對照組的原因是伽師瓜果實(shí)的細(xì)胞壁被鏈格孢菌分泌的細(xì)胞壁降解酶降解，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量滲出，鏈格孢菌利用這些營養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖導(dǎo)致伽師瓜腐爛，失重率上升[18]。受粉紅單端孢侵染的伽師瓜失重率呈現(xiàn)下降的趨勢[18]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

2.2.2 鏈格孢菌侵染對伽師瓜硬度的影響

鏈格孢菌侵染對伽師瓜硬度的影響見圖3。

圖3 鏈格孢菌侵染對伽師瓜硬度的影響Fig.3 Effect of Alternaria alternata infection on hardness of Jiashi melon

如圖3所示，采后伽師瓜經(jīng)鏈格孢菌無損接菌侵染后，接種組與對照組伽師瓜果實(shí)硬度隨著貯藏時間的延長而降低，接種組與對照組果實(shí)硬度總體呈現(xiàn)下降的趨勢。在貯藏期達(dá)到18 d時接種組與對照組果實(shí)硬度最小，此時接種組果實(shí)硬度為0.33 kg/cm2，對照組為0.31 kg/cm2。貯藏期間接種組硬度低于對照組的原因是，病原菌的侵染導(dǎo)致了伽師瓜細(xì)胞壁的降解，近而導(dǎo)致果實(shí)硬度降低。受粉紅單端孢侵染的伽師瓜硬度呈現(xiàn)下降的趨勢[18]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

2.2.3 鏈格孢菌侵染對伽師瓜可溶性固形物含量的影響

鏈格孢菌侵染對伽師瓜可溶性固形物含量的影響見圖4。

圖4 鏈格孢菌侵染對伽師瓜可溶性固形物含量的影響Fig.4 Effect of Alternaria alternata infection on soluble solid content of Jiashi melon

如圖4所示，采后伽師瓜經(jīng)鏈格孢菌無損接菌侵染后，接種組與對照組伽師瓜果實(shí)可溶性固形物含量隨著貯藏時間的延長先上升后下降。在貯藏期達(dá)到9 d時接種組可溶性固形物含量達(dá)到峰值，為12.85°Brix；對照組在12 d時達(dá)到峰值，為11.63°Brix，在18 d時接種組與對照組都達(dá)到最小值，分別為9.36、9.65°Brix。推測采后伽師瓜在貯藏期間可溶性固形物含量先升高再降低的原因，在貯藏前期屬于伽師瓜的后熟階段，此時無論是接種組還是對照組可溶性固形物含量都是呈上升的趨勢，當(dāng)鏈格孢菌開始侵染時，伽師瓜為了抵抗病原菌的侵染開始消耗果實(shí)中的可溶性固形物故而接種組的可溶性固形物含量迅速下降。受粉紅單端孢侵染的伽師瓜可溶性固形物含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[18]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

探究伽師瓜果實(shí)不同網(wǎng)紋以及不同組織部位在對病原微生物侵染的抵抗能力上的差異，可以進(jìn)一步對植物抗病機(jī)制進(jìn)行研究。以上試驗(yàn)結(jié)果表明在伽師瓜采后的病原微生物侵染階段大網(wǎng)紋病害發(fā)生率最高，小網(wǎng)紋次之，無網(wǎng)紋最低，且失重率會隨著貯藏時間的延長而上升，果實(shí)硬度隨之下降，可溶性固形物含量因果實(shí)的后熟作用呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。伽師瓜采摘后，呼吸作用成為其果實(shí)新陳代謝的主導(dǎo)過程[19]。呼吸作用協(xié)同伽師瓜自身酶進(jìn)行生理活動，此過程會消耗伽師瓜果實(shí)中的脂肪酸以及多糖等，導(dǎo)致果實(shí)失去水分，硬度下降[20]。

2.3 鏈格孢菌侵染對伽師瓜果實(shí)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性的影響

2.3.1 鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織PAL活性的影響

鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織PAL活性的影響見圖5。

圖5 鏈格孢菌侵染對伽師瓜外果皮、內(nèi)果皮、果肉PAL活性的影響Fig.5 Effect of Alternaria alternata infection on PAL activity of exocarp，endocarp and pulp of Jiashi melon

由圖5可知，鏈格孢菌無損侵染伽師瓜大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋以及無網(wǎng)紋的外果皮、內(nèi)果皮、果肉組織，PAL活性隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢且均高于對照組。外果皮組織無網(wǎng)紋組酶活性最先達(dá)到峰值，其次是小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，分別為侵染9、12、15 d，無網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組酶活性分別為0 d時的1.93、2.86、2.89倍。內(nèi)果皮組織無網(wǎng)紋組及大網(wǎng)紋組在9 d達(dá)到峰值，小網(wǎng)紋在侵染12 d達(dá)到峰值，此時各網(wǎng)紋組分別為0 d時的3.28、2.37、9.05倍。果肉組織大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組均在侵染9 d達(dá)到峰值，此時大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組酶活性分別為0 d時的2.05、2.00、1.43倍。在18 d的侵染過程中，外果皮組織無網(wǎng)紋組的PAL活性顯著高于小網(wǎng)紋組和無網(wǎng)紋組（p＜0.05）；接種組內(nèi)果皮組織在 3 d～6 d時大網(wǎng)紋PAL活性高于小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組，無顯著差異（p＞0.05），9 d～12 d時無網(wǎng)紋組 PAL 活性高于小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，差異顯著（p＜0.05）；接種組果肉組織9 d時小網(wǎng)紋組PAL酶活性最高，大網(wǎng)紋組次之，無網(wǎng)紋最小，差異顯著（p＜0.05）。文獻(xiàn)[12]研究表明鏈格孢菌侵染會增強(qiáng)采后甜瓜果實(shí)PAL活性且侵染期間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。結(jié)合各網(wǎng)紋接種組病害發(fā)生率得出，無網(wǎng)紋接種組在受到病原菌侵染時會更快地啟動苯丙烷代謝途徑，增強(qiáng)自身的抗病性。

2.3.2 鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織4CL活性的影響

鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織4CL活性的影響見圖6。

圖6 鏈格孢菌侵染對伽師瓜外果皮、內(nèi)果皮、果肉4CL活性的影響Fig.6 Effect of Alternaria alternata infection on 4CL activity of exocarp，endocarp and pulp of Jiashi melon

由圖6所示，鏈格孢菌無損侵染伽師瓜大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋以及無網(wǎng)紋的外果皮、內(nèi)果皮、果肉組織，4CL活性都隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且高于對照組。外果皮組織大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組均在侵染9 d達(dá)到峰值。無網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組酶活性分別為0 d時的1.48、1.02、1.80倍。內(nèi)果皮組織無網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組4CL活性在侵染6 d達(dá)到峰值，大網(wǎng)紋組在9 d達(dá)到峰值，此時大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組分別為0 d時的1.28、1.14、1.20倍。果肉組織大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組4CL活性均在侵染的6 d達(dá)到峰值，此時大、小、無網(wǎng)紋酶活性分別為0 d時的 1.04、1.09、1.27倍。

在18 d的侵染過程中，接種組外果皮組織大網(wǎng)紋組4CL活性在9 d時顯著高于大網(wǎng)紋組和小網(wǎng)紋組（p＜0.05）；接種組內(nèi)果皮組織無網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組4CL活性最先達(dá)到峰值，顯著高于大網(wǎng)紋組（p＜0.05）；接種組果肉組織無網(wǎng)紋組4CL活性在6 d時顯著高于大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組（p＜0.05）。文獻(xiàn)[12]研究表明，鏈格孢菌侵染會引起采后甜瓜果實(shí)的苯丙烷代謝通過合成類黃酮等物質(zhì)增強(qiáng)自身的抗病性，4CL作為苯丙烷代謝過程中的最后一個酶，在侵染期間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

PAL、4CL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，PAL作為起始酶同時也是限速酶，而4CL則是此反應(yīng)的最后一個酶，苯丙烷代謝在植物抗病過程中起到了至關(guān)重要的作用，它們?yōu)轭慄S酮、木質(zhì)素等下游產(chǎn)物的合成提供原料[21]。經(jīng)大量試驗(yàn)驗(yàn)證植物在受到病原菌的侵染時，PAL活性有明顯提高，抗病組織高于感病組織[21]，因此PAL、4CL與果實(shí)的抗病性呈正相關(guān)[22-25]。

2.4 鏈格孢菌侵染對伽師瓜果實(shí)CHT和GLU活性的影響

2.4.1 鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織CHT活性的影響

鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織CHT活性的影響見圖7。

圖7 鏈格孢菌侵染對伽師瓜外果皮、內(nèi)果皮、果肉CHT活性的影響Fig.7 Effect of Alternaria alternata infection on CHT activity of exocarp，endocarp and pulp of Jiashi melon

由圖7可知，鏈格孢菌無損侵染伽師瓜大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋以及無網(wǎng)紋的外果皮、內(nèi)果皮、果肉組織，CHT活性都隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均高于對照組。外果皮組織大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組酶活性均在侵染9 d時達(dá)到峰值，大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組酶活性分別為0 d時的3.37、3.04、2.66倍。內(nèi)果皮組織小網(wǎng)紋組酶活性最先達(dá)到峰值為侵染9 d，大網(wǎng)紋組以及無網(wǎng)紋組酶活性均在12 d達(dá)到峰值，此時小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組別為0 d時的5.23、1.63、4.13倍。果肉組織大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組均在侵染9 d達(dá)到峰值，此時大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組酶活性分別為0 d時的5.60、4.24、3.12倍。在18 d的侵染過程中，外果皮組織無網(wǎng)紋組CHT活性均高于大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組；接種組內(nèi)果皮組織在0～6 d時小網(wǎng)紋CHT活性高于大網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組，顯著差異（p＜0.05），9 d～12 d時無網(wǎng)紋組 CHT 活性高于小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，差異顯著（p＜0.05）；接種組果肉組織在0～3 d時無網(wǎng)紋組CHT活性低于小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，顯著差異（p＜0.05），6 d～12 d 時無網(wǎng)紋組CHT活性高于小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，差異顯著（p＜0.05）。文獻(xiàn)[6]研究結(jié)果表明，鏈格孢菌在侵染甜瓜果實(shí)后會刺激CHT的產(chǎn)生，并且提高自身活力，降解病原菌的細(xì)胞壁，提高自身抗病性，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

2.4.2 鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織GLU活性的影響

鏈格孢菌侵染對伽師瓜不同組織GLU活性的影響見圖8。

圖8 鏈格孢菌侵染對伽師瓜外果皮、內(nèi)果皮、果肉GLU活性的影響Fig.8 Effect of Alternaria alternata infection on GLU activity of exocarp，endocarp and pulp of Jiashi melon

由圖8可知，鏈格孢菌無損侵染伽師瓜大網(wǎng)紋、小網(wǎng)紋以及無網(wǎng)紋的外果皮、內(nèi)果皮、果肉組織，GLU活性都隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均高于對照組。外果皮組織大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組在侵染12 d達(dá)到峰值，無網(wǎng)紋組在15 d達(dá)到峰值，大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組酶活性分別為0 d時的5.23、4.59、5.04倍。內(nèi)果皮組織大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組在侵染9 d達(dá)到峰值，無網(wǎng)紋組在12 d達(dá)到峰值，此時各網(wǎng)紋組分別為0 d時的4.47、3.40、3.31倍；果肉組織大網(wǎng)紋（p＜0.05）。文獻(xiàn)[6]研究結(jié)果表明，GLU水解真菌的細(xì)胞壁，在鏈格孢菌侵染甜瓜果實(shí)時，甜瓜自身的GLU被刺激，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物水解真菌細(xì)胞壁使其失活，提高自身抗病性，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。

CHT與GLU是植物在抗病過程中起到反擊作用的關(guān)鍵酶，其原理是水解構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)與葡聚糖，通過降解真菌細(xì)胞壁從而使病原菌失去致病能力，提高果實(shí)的抗病能力[26-27]，果實(shí)中CHT與GLU的活性與抗病性呈正相關(guān)[28-31]。

3 結(jié)論

采后伽師瓜在貯藏期間，其自身酶進(jìn)行生理活動并協(xié)同呼吸作用，消耗伽師瓜果實(shí)中的脂肪酸以及多糖等，導(dǎo)致果實(shí)失去水分，硬度下降，從而影響伽師瓜各項(xiàng)指標(biāo)，接種組與對照組失重率在貯藏期間均呈現(xiàn)上升趨勢，且接種組失重率顯著高于對照組，可溶性固形物含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，接種組變化趨勢顯著大于對照組，硬度在貯藏期間呈下降趨勢，接種組硬度顯著小于對照組。接種病原菌的3種網(wǎng)紋發(fā)病率，大網(wǎng)紋病害發(fā)生率最高，小網(wǎng)紋次之，無網(wǎng)紋最低。

苯丙烷代謝以及CHT與GLU在植物抗病過程中都起到了關(guān)鍵性作用，它們?yōu)轭慄S酮、木質(zhì)素等下游產(chǎn)物的合成提供原料。CHT與GLU通過水解構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)與葡聚糖，通過降解真菌細(xì)胞壁從而使病原菌失去致病能力，提高果實(shí)的抗病能力。本試驗(yàn)通過測定采后伽師瓜不同網(wǎng)紋及不同組織受病原菌侵染后苯丙烷代謝相關(guān)酶以及CHT與GLU的活性，對其抗病性進(jìn)行比較，得出結(jié)論：伽師瓜外果皮、內(nèi)果皮、果肉均為無網(wǎng)紋組＞小網(wǎng)紋組＞大網(wǎng)紋組，且外果皮＞內(nèi)果皮＞果肉。組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組均在侵染的9 d達(dá)到峰值，此時大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組、無網(wǎng)紋組酶活性分別為0 d時的4.50、4.20、4.66倍。在18 d的侵染過程中，接種組外果皮組織無網(wǎng)紋組GLU活性均高于大網(wǎng)紋組、小網(wǎng)紋組，差異顯著（p＜0.05）；接種組內(nèi)果皮組織在 3 d～6 d時無網(wǎng)紋組GLU活性低于小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，9 d～15 d時無網(wǎng)紋組GLU活性高于小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，差異顯著（p＜0.05）；接種組果肉組織在 6 d～12 d時無網(wǎng)紋組GLU活性高于小網(wǎng)紋組、大網(wǎng)紋組，差異顯著