加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平對糖尿病大鼠心肌纖維化及核因子κB、結(jié)締組織生長因子表達的影響

蔡素華，任禮錫

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510168)

糖尿病心肌病屬于糖尿病患者常見并發(fā)癥之一，疾病發(fā)病因素上，細胞學(xué)病變以及心肌細胞間纖維沉積屬于引起心臟舒張功能損傷，糖尿病心肌病的關(guān)鍵因素[1]。核因子κB(NF-κB)幾乎可以在所有的動物細胞中發(fā)現(xiàn)，主要是參加細胞對外界刺激的響應(yīng)，在細胞炎性反應(yīng)以及免疫應(yīng)答過程中起到關(guān)鍵性作用，若NF-κB錯誤常容易引起自身免疫疾病[2]。結(jié)締組織生長因子(CTGF)則是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種致纖維化生長因子，屬于多組織器官纖維化形成過程的重要介質(zhì)。對糖尿病的患者，顯示奧氮平除了具有顯著抗精神病的作用，而且有潛在的器官保護作用[3]。加味芩桂術(shù)湯是一種活血寧心、健脾利濕及溫陽化飲的治療藥物，可降低肺動脈高壓及改善心功能，而對于應(yīng)用加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平對延緩糖尿病心肌病的相關(guān)機制卻有待進一步的研究[4]。本次研究中，建立了糖尿病大鼠模型，分析了應(yīng)用加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平對大鼠心肌纖維化、NF-κB以及CTGF表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料:選擇70只雄性Wistar大鼠，均由南京軍區(qū)總院實驗動物中心提供。對所有的大鼠均是建立模型，主要是給予大鼠進行10h的禁食，然后單次經(jīng)腹腔內(nèi)注入用0.1%mmol/L無菌檸檬酸緩沖液配制的STZ給予單次腹腔注射，注射量為50 mg/kg。注射藥物72 h后取尾靜脈進行血糖的測定，測定血糖水平≥16.7 mmol/L及選取為糖尿病大鼠。將大鼠分成四組，即正常對照組(n=10)，糖尿病大鼠分成模型組(n=20)、奧氮平組(n=20)、加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平組(n=20)。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2試劑:美國Sigma公司生產(chǎn)的鏈脲佐菌素；武漢博士德公司生產(chǎn)的NF-κB多克隆抗體；美國Bi Vision公司生產(chǎn)的CTGF多克隆抗體；申能博才生化公司生產(chǎn)的蛋白提取試劑盒。

1.3用藥方法:正常對照組給予注射等量檸檬酸緩沖液；模型組每天予以同體積生理鹽水灌胃；奧氮平組每天以5 mg/kg灌胃；加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平組每天以5 mg/kg奧氮平聯(lián)合5 mg/kg加味芩桂術(shù)湯灌胃(基礎(chǔ)組方：丹參、黃芪、茯苓各30 g，葶藶子、白術(shù)、桂枝各15 g，桔梗、陳皮、大腹皮、川芎各10 g，酒軍、麻黃各8 g，甘草6 g。辨證加減，對紫紺嚴(yán)重者加澤蘭20 g；氣虛乏力者加人參10 g；腹脹納差者加厚樸15 g；痰多咯痰不爽者加萊菔子5 g、枳實5 g、半夏5 g。藥物加水濃煎后裝袋)。各組小鼠用藥時間均是12周，在整個實驗期間所有的大鼠均予以標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)，避免應(yīng)用胰島素。

1.4觀察指標(biāo):所有的大鼠均在用藥12周后稱重，然后將大鼠處死并且收集3 ml的腹主靜脈血液，檢測血糖以及糖化血紅蛋白水平，打開大鼠胸腔并迅速取出心臟，應(yīng)用冰鹽水沖洗及剝離，濾干水分并且置于電子天平上稱重。①心肌纖維化：主要觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，主要是采取電鏡檢查，選擇規(guī)格為1 mm3大小心室肌組織，置入到3%的戊二醛中進行固定，之后用1%餓酸固定1 h，丙酮逐級脫水，然后應(yīng)用透射電鏡進行觀察。②NF-κB檢測：常規(guī)制作石蠟切片，按規(guī)范程序脫蠟，應(yīng)用3% H2O2做滅活處理，微波抗原修復(fù)及BSA封閉液封閉，加NF-κB多克隆抗體，置入冰箱中過夜并加羊抗兔IgG，加入酶標(biāo)記物及進行DAB顯色，脫水后封片。借助Leica圖像系統(tǒng)，在光學(xué)顯微鏡的幫助下放大400倍，每一張切片均隨機選擇5個視野獲取圖像，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計算各圖像吸光度值，吸光度值(D)=陽性區(qū)域總面積×陽性區(qū)域平均吸光度，5個視野圖像均值為各切片D值。③CTGF：選取大約100 mg心肌組織應(yīng)用冰冷PBS連續(xù)漂洗2次，眼科剪碎并置入勻漿器，即刻加蛋白提取緩沖液，高速組織勻漿，冰上靜止30 min，經(jīng)12 000次/min的速度持續(xù)離心10 min，選取上清液做蛋白定量測定，電泳、變性及電轉(zhuǎn)膜，CTGF抗體進行Western印跡分析，借助DAB顯影方式，借助生物凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描定量總半定量分析。

2 結(jié)果

2.1心肌纖維化:電鏡下觀察模型組的大鼠在心肌間質(zhì)內(nèi)部可見大量的膠原纖維分布，心肌細胞排列紊亂并且肌原纖維呈現(xiàn)灶性溶解，肌絲扭曲且斷裂，線粒體明顯腫脹及增多。奧氮平大鼠左室心肌組織改變較模型組輕，細胞排列比較整齊，可見T管系統(tǒng)略微擴張，線粒體大小比較一致及排列規(guī)整，間質(zhì)內(nèi)膠原堆積減少。加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平組大鼠左室心肌細胞改變較奧氮平組明顯減輕，細胞排列整齊，肌原纖維斷裂，T管系統(tǒng)未見擴張。

2.2NF-κB、CTGF表達:在各組大鼠的NF-κB、CTGF表達情況上，模型組>奧氮平組>加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平組>正常對照組，兩兩組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠NF-κB、CTGF表達情況比較

3 討論

糖尿病是一種常見的慢性疾病，隨著生活方式及飲食方式的改變，疾病發(fā)病率不斷升高，這嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及威脅生命健康[5]。糖尿病的典型表現(xiàn)為高血糖，若持續(xù)處在高血糖狀態(tài)可增加各種心血管事件的發(fā)生率，因此研究糖尿病與心肌指標(biāo)的聯(lián)系對于疾病的治療有積極意義[6]。

本次研究中，納入了大鼠作為研究資料，對大鼠分成非糖尿病及糖尿病，并且糖尿病大鼠也根據(jù)治療方式不同分成了三組。結(jié)果顯示在心肌纖維化上，經(jīng)12周的治療后，同模型組的大鼠進行對比，奧氮平組、加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平組均在電鏡下可見間質(zhì)纖維化減輕，心肌纖維排列整齊，線粒體水腫明顯減輕，且以聯(lián)合治療的小鼠改變明顯。說明加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平可改善糖尿病心肌纖維化情況，推測可能是來訥河藥物具有減輕膠原聚集作用。加味芩桂術(shù)湯中的主要功效是活血寧心、健脾利濕及溫陽化飲等，對其中的一些藥物經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究也顯示應(yīng)用黃芪可以促進慢性肺心病的T細胞功能，降低肺動脈壓及減輕右心前負荷，川芎有助于松弛血管平滑肌及擴張肺血管，降低肺動脈高壓[7]。此外本次研究結(jié)果也顯示，經(jīng)過12周的干預(yù)治療后，加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平組在NF-κB、CTGF表達水平上明顯比模型組與奧氮平組更低，數(shù)值同未建立糖尿病模型的正常對照組一致率高，推測原因是應(yīng)用加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平的方式可以有效調(diào)節(jié)NF-κB，以直接或者是間接方式對下游的靶基因如CTGF等細胞因子進行抑制，從而起到有效抵抗心肌纖維化的作用[8]。加味芩桂術(shù)湯的用藥上，經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證實促血管緊張的方式，調(diào)節(jié)CTGF的活性，抑制大鼠CTGF表達及改善大鼠心肌纖維化，延緩疾病心肌病變的持續(xù)進展。

綜上所述，對于糖尿病大鼠，使用加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平的給藥治療方式，可以通過有效調(diào)節(jié)心肌NF-κB、CTGF表達的作用，有效改善心肌纖維化，減輕心臟負擔(dān)，如此可為糖尿病心肌病變治療提供可靠依據(jù)及參考。