miR-198通過靶向ZEB2調(diào)控EMT過程抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究

陳 偲，李忠輝，王 穎

(1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六九醫(yī)院感染科, 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古包頭市昆都侖區(qū)包鋼醫(yī)院a.腫瘤內(nèi)科；b.老年病科，內(nèi)蒙古包頭 014010)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）簡(jiǎn)稱肝癌，是目前全球發(fā)病率第五和死亡率第三的惡性腫瘤，其中約50%的新發(fā)HCC 病例來自中國(guó)，每年大約60 萬患者因HCC 死亡[1-2]。HCC 因缺乏敏感度和特異度高的腫瘤分子標(biāo)志物，早期診斷困難，故從分子機(jī)制上探索HCC 的發(fā)生和發(fā)展，尋找有效的生物治療靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的重要方向[3]。微小核糖核酸（microRNAs, miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，大約由21 ～25個(gè)核苷酸組成，通?？砂邢蛞粋€(gè)或者多個(gè)mRNA通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標(biāo)mRNAs 而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與腫瘤多種生物學(xué)過程，例如細(xì)胞分化、增殖、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）等[4]。越來越多研究表明miRNAs 在肺癌、食管癌、胰腺癌及結(jié)腸癌等[5-9]癌癥中普遍存在表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象，廣泛參與多種腫瘤進(jìn)程，是一種新的腫瘤研究分子靶標(biāo)。目前有關(guān)miR-198 在肺腺癌[10]、乳腺癌[11]、卵巢癌[12]中的異常表達(dá)均有報(bào)道，但是miR-198 與HCC 的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究鮮少。因此本研究以HCC 細(xì)胞Huh7 為研究對(duì)象，探討miR-198 對(duì)Huh7 細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 研究對(duì)象 選取人HCC 細(xì)胞株HepG2，Hep3G，MHCC97H，Huh7 及人正常肝細(xì)胞chang liver，LO2 進(jìn)行研究，所有細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。選取2020年1 ～3月解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六九醫(yī)院病理科留存的20 例HCC 患者的癌組織及鄰近正常組織標(biāo)本，經(jīng)病理診斷后在液氮中低溫保存?zhèn)溆茫换颊咝g(shù)前未接受任何相關(guān)放化療及新輔助治療。

1.2 儀器及試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；胰蛋白酶（美國(guó)gibco 公司）；Trizol 試劑（捷世康生物科技有限公司）；脂質(zhì)體2000（北京天根生化科技公司）；miR-198 mimics，mimics NC 由上海生工生物工程有限公司合成；pcDNA3.1-ZEB2 質(zhì)粒、空載體vector 質(zhì)粒、ZEB2 3’-UTR-wt，ZEB2 3’-UTR-mut 報(bào)告基因質(zhì)粒由Invitrogen 公司設(shè)計(jì)構(gòu)建；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Sigma 公司）；熒光定量PCR 擴(kuò)增儀（Applied Biosystems 公司）；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；免疫印跡所需兔抗人ZEB2 多克隆抗體及HRP 二抗（Abcam 公司）；CCK-8 試劑盒（碧云天生物公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：本研究中所有細(xì)胞株均使用含10g/dl 胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，0.25 g/dl 胰蛋白酶消化，吹打制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期待測(cè)細(xì)胞以1×105/孔接種于6 孔板，待生長(zhǎng)密度至85%時(shí)參照脂質(zhì)體2000 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，后常規(guī)培養(yǎng)2 天，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分組：轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 的細(xì)胞作為miR-198 過表達(dá)組（miR-198 mimics），轉(zhuǎn)染mimics NC 作為陰性對(duì)照組（mimics NC），不作任何干預(yù)的細(xì)胞為空白對(duì)照組（Blank），轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 與pcDNA3.1-ZEB2 的細(xì)胞作為共轉(zhuǎn)染組（miR-198 mimics+pcDNA3.1-ZEB2）。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：檢索生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-198 的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)ZEB2可能是miR-198 的靶基因。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，構(gòu)建包含miR-198 結(jié)合區(qū)域在內(nèi)的ZEB2 3’-UTR-wt 野生型和ZEB2 3’-UTR-mut突變型熒光報(bào)告基因質(zhì)粒，與miR-198 mimics 或mimicsNC 共轉(zhuǎn)染到待測(cè)細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。

1.3.4 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)：Trizol 法提取組織及細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板配置反應(yīng)體系行PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增體系為：PCR 正反向引物 各1 μl，SYBR Premix EaqTMII(2×) 12.5 μl，cDNA 2 μl，終體積25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s，循環(huán)40 次。以U6 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-198 和ZEB2 mRNA 相對(duì)表達(dá)。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.5 Western blot 實(shí)驗(yàn)：收集細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5 g/dl 脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗孵育過夜；次日PBS 清洗2 次，加入HRP 二抗孵育1 h，PBS 清洗2 次，ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-Actin 為內(nèi)參采用Gel-Pro Analyzer 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μl，24 h 后避光條件下加入10 μl 的CCK-8 試劑，培養(yǎng)0，24，48，72 h 時(shí)在450 nm 波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A值），繪制細(xì)胞增殖曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.3.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞胰酶消化制成細(xì)胞懸液，1×106/孔接種于6 孔板，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)24 h；次日用槍頭垂直于6 孔板劃痕，PBS 沖洗2 次，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0 h，48 h 拍照，并測(cè)量劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移愈合率。細(xì)胞遷移愈合率 =（遷移寬度/劃痕寬度）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間差異比較采用one way ANOVO 分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；癌組織及癌旁正常組織中差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-198 在HCC 組織及細(xì)胞中表達(dá) qRTPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，20 例HCC 組織中miR-198 相對(duì)表達(dá)量（0.354±0.022）明顯低于鄰近正常組織（4.762±1.135），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.365，P＜0.001）。與人正常肝細(xì)胞LO2 相比，HCC 細(xì)胞HepG2（0.589±0.103），Hep3G（0.495±0.086），MHCC97H（0.558±0.056），Huh7（0.362±0.045）中miR-198 相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)不同程度的降低（t=17.159，19.446，17.590，20.315，均P＜0.001），其中Huh7 細(xì)胞表達(dá)量最低，見圖1，選取Huh7 細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-198 在不同HCC 細(xì)胞株及人正常肝細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2 miR-198對(duì)HCC細(xì)胞增殖和遷移的影響 qRTPCR 檢測(cè)顯示，miR-198 mimics 組細(xì)胞中miR-198表達(dá)較Blank組和mimics NC組顯著升高（t=13.433，13.256，均P＜0.001），見圖2。表明miR-198 mimics 的轉(zhuǎn)染使Huh7 細(xì)胞中miR-198 過表達(dá)，轉(zhuǎn)染有效，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 后miR-198 的表達(dá)

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與Blank 組和mimics NC 組相比，miR-198 mimics 組的增殖能力明顯下降（P＜0.05），見圖3。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Blank 組和mimics NC 組相比，miR-198mimics組Huh7 細(xì)胞遷移能力顯著降低（F=52.771，P＜0.001），見圖4。

2.3 miR-198 對(duì)HCC 細(xì)胞EMT 相關(guān)標(biāo)志蛋白的影響 見圖5。Western blot 檢測(cè)EMT 相關(guān)標(biāo)志蛋白E-cadherin，N-cadherin，Vimentin 表達(dá)水平顯示，miR-198 mimics 組細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)較Blank組和mimics-NC 組顯著升高（P＜0.01），N-cadherin和Vimentin 表達(dá)較Blank 組和mimics-NC 組顯著降低（均P＜0.01）。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 對(duì)Huh7 細(xì)胞體外增殖的影響

圖4 轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 對(duì)Huh7 細(xì)胞體外遷移的影響

圖5 轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 對(duì)EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖6 ZEB2 3’-UTR 與miR-198 的結(jié)合位點(diǎn)

圖7 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)Huh7 細(xì)胞中熒光素酶活性

2.4 miR-198 與ZEB 靶向結(jié)合關(guān)系驗(yàn)證 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZEB2 3’-UTR 與miR-198 存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖6。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證顯示，miR-198 mimics 組ZEB2-3’-UTR-WT 質(zhì)粒熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.01），ZEB2-3’-UTRMUT 質(zhì)粒熒光強(qiáng)度變化無顯著影響（P＞0.05），見圖7。提示ZEB2 是miR-198 的靶基因。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于Blank 組和mimics NC 組，miR-198 mimics 組細(xì)胞中ZEB2 mRNA 和ZEB2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（F=17.696，436.609，P＜0.05），見圖8。表明miR-198 靶向負(fù)調(diào)控ZEB2 表達(dá)。

2.5 HCC 組織中ZEB2 表達(dá)及與miR-198 的相關(guān)性 qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，20 例HCC 臨床組織中ZEB2 相對(duì)表達(dá)量（3.621±1.143）明顯高于鄰近正常組織（0.736±0.030），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.284，P＜0.001）；Sperman 相關(guān)性分析顯示，HCC 組織中miR-198 和ZEB2 編導(dǎo)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.702，P＜0.05）。

圖8 qRT-PCR 和Western blot 檢測(cè)miR-198 mimics 對(duì)ZEB2 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響

2.6 miR-198 靶向調(diào)控ZEB2 抑制HCC 細(xì)胞的增殖和遷移 研究轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ZEB2 過表達(dá)細(xì)胞中ZEB2，經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，過表達(dá)ZEB2 明顯促進(jìn)了HCC 細(xì)胞的增殖和遷移（P＜0.05），提示ZEB2 發(fā)揮原癌基因?qū)傩裕辉趍iR-198 mimic組共轉(zhuǎn)然pcDNA3.1-ZEB2 后，細(xì)胞增殖和遷移能力較單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 組顯著增加（P＜0.05），基本恢復(fù)至正常水平，見圖9, 圖10。提示共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ZEB2 能夠逆轉(zhuǎn)miR-198 mimics 對(duì)Huh7 細(xì)胞的增殖和遷移的抑制作用，由此可見miR-198 通過靶向負(fù)調(diào)控ZEB2 表達(dá)可抑制Huh7 細(xì)胞的增殖和遷移。

圖9 共轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 和pcDNA3.1-ZEB2對(duì)Huh7 細(xì)胞體外增殖的影響

圖10 共轉(zhuǎn)染miR-198 mimics 和pcDNA3.1-ZEB2 對(duì)Huh7 細(xì)胞體外遷移的影響

2.7 miR-198 靶向調(diào)控ZEB2 抑制HCC 細(xì)胞的EMT過程 Western blot 檢測(cè)顯示，miR-198 mimics+vector 組細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)較Blank 組顯著升高（P＜0.01），N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)較Blank 組則顯著降低（P＜0.01）， 與miR-198 mimics 組無明顯差異（P＞0.05）； 在miR-198 mimics 組細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ZEB2 后，E-cadherin 和N-cadherin，Vimentin 表達(dá)水平被顯著逆轉(zhuǎn)，提示過表達(dá)ZEB2 逆轉(zhuǎn)了miR-198 mimics對(duì)EMT 的抑制作用，見圖11。說明miR-198 靶向調(diào)控ZEB2 可能通過EMT 途徑參與HCC 細(xì)胞的增殖和遷移。

3 討論

我國(guó)HCC 占全球肝癌發(fā)生率的50%左右，每年因HCC 導(dǎo)致近60 萬人死亡，乙型肝炎病毒感染（HBV）是HCC 的常見病因，其他危險(xiǎn)因素常見黃曲霉素B1、過量酒精濫用、藥物、血色素沉著病和肥胖等[2,13]。miRNAs 具有高度保守性，不易被降解，調(diào)控下游靶基因和下游蛋白表達(dá)是miRNAs 調(diào)控癌癥發(fā)展的主要機(jī)制。miRNAs 即可作為預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)，也可作為治療癌癥的分子靶點(diǎn)，因此尋找與癌癥發(fā)生相關(guān)的miRNAs及下游靶基因?qū)⒂兄诎┌Y的診斷和治療[14-15]。

圖11 miR-198 靶向ZEB2 抑制HCC 細(xì)胞EMT 過程

近年來研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織細(xì)胞中miR-198顯著低表達(dá)，起抑癌基因的作用[11]；非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，miRNA-198 抑制HGF/c-MET 信號(hào)通路可克服放療耐藥性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]；王磊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HCC 組織中miR-198 表達(dá)顯著降低，與臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān)，miR-198 低表達(dá)促進(jìn)肝癌進(jìn)展，提示其作為一種抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而本研究探究發(fā)現(xiàn)，HCC 組織及細(xì)胞中miR-198 同樣顯著低表達(dá)，其過表達(dá)顯著抑制了HCC 細(xì)胞的增殖和遷移，表明miR-198 在HCC 發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，故對(duì)其進(jìn)行研究具有積極意義。

研究運(yùn)用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-198 靶基因，發(fā)現(xiàn)E 盒結(jié)合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2，ZEB2）與miR-198 存在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZEB2 是miR-198 的靶基因，miR-198 靶向負(fù)調(diào)控ZEB2 表達(dá)。ZEB2是由ZFHX1B 基因所編碼的蛋白，其CDS 區(qū)是3572bp，擁有8 個(gè)內(nèi)含子和9 個(gè)外顯子。ZEB2是ZEB 家族的一員，ZEB 家族是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT） 的重要調(diào)控因子[18]。發(fā)現(xiàn)ZEB2 通過抑制E-cadherin，mac-1 和Mucoprotein，Desmocollin 等相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄，能夠上調(diào)N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)，參與EMT 發(fā)生過程[19-20]。此外，ZEB2 表達(dá)失調(diào)與多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括結(jié)直腸癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌等。而本研究結(jié)果顯示miR-198 mimics 可以上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)，下調(diào)N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)，說明miR-198 過表達(dá)抑制了HCC 細(xì)胞EMT 過程；進(jìn)一步在miR-198 mimics 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ZEB2，發(fā)現(xiàn)ZEB2 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-198 mimics 對(duì)HCC 細(xì)胞增殖、遷移能力和EMT 的抑制過程，提示miR-198 通過靶向下調(diào)ZEB2 抑制HCC 細(xì)胞的增殖和遷移與其抑制EMT 過程有關(guān)。本研究探討了miR-198 調(diào)控HCC 發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，為其靶向治療提供了分子靶標(biāo)及思路，但癌基因參與調(diào)控腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制復(fù)雜，故miR-198 在HCC 中發(fā)揮作用的更深入的信號(hào)分子通路還需進(jìn)一步繼續(xù)探究。綜上所述，HCC 組織和細(xì)胞中miR-198 顯著低表達(dá)，其通過靶向調(diào)控ZEB2 抑制細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而參與HCC 的發(fā)生發(fā)展。miR-198/ZEB2有望成為HCC 生物治療的潛在靶點(diǎn)之一。