感染性心內(nèi)膜炎患者外周血中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)水平與T細(xì)胞水平表達和預(yù)后的相關(guān)性研究

李 珂，宋莉莉，紀(jì)德江，趙會芹，王海平

（青島阜外心血管病醫(yī)院a.心外科；b.心內(nèi)科，山東青島 266034）

感染性心內(nèi)膜炎(infective endocarditis，IE)是致病微生物經(jīng)血路直接侵犯到患者心臟瓣膜、心內(nèi)膜及大動脈內(nèi)膜所致的炎癥性疾病，多發(fā)于先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病及免疫力低下人群[1-2]。感染、炎癥等可激活機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子，中性粒細(xì)胞是天然免疫中數(shù)量最多、反應(yīng)最快的細(xì)胞，在感染性疾病中扮演重要角色。當(dāng)病原體感染時，中性粒細(xì)胞可通過吞噬、脫顆粒，產(chǎn)生中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap nets，NETs )來攻擊入侵的病原體，另外中性粒細(xì)胞也參與適應(yīng)性免疫，可作為抗原提呈細(xì)胞向T 細(xì)胞提呈抗原，從而間接調(diào)控T 細(xì)胞免疫[3-4]。NETs 是活化的中性粒細(xì)胞釋放的可限制病原體擴散的胞外纖維，除能夠抑制病原體生長與定植外，有研究發(fā)現(xiàn)，病原體可在NETs 中存活，且會對內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，表明NETs 的釋放也有促進病原的致病作用[5]。目前NETs 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡[6]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[7]、糖尿病[8]、腫瘤[9]等疾病多有報道，但在IE 患者中NETs 水平變化未見報道。本研究旨在觀察IE 患者外周血NETs 水平變化，并探討其與T 細(xì)胞水平表達和患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年11月～2021年2月在青島阜外心血管病醫(yī)院治療的53 例IE 患者作為IE 組，其中男性32 例，女性21 例；年齡18～76（56.54±13.43）歲；其中8 例無基礎(chǔ)心臟疾病，18 例非風(fēng)濕性心臟病，14 例先天性心臟病，7 例風(fēng)濕性心臟病，4 例人工瓣膜植入，2 例心臟起搏器植入。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床癥狀及生化指標(biāo)符合IE診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②兩次血培養(yǎng)陽性；③經(jīng)超聲心動圖確診；④患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非IE 患者；②并發(fā)其他感染性疾病；③并發(fā)免疫系統(tǒng)疾病者；④并發(fā)惡性腫瘤者；⑤并發(fā)血液系統(tǒng)疾病者；⑥并發(fā)認(rèn)知功能障礙者；⑦妊娠及哺乳期婦女。另選取同期進行體檢的50 例健康人群作為對照組，其中男性25例，女性25例，年齡18～75（55.32±12.35）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.121，P=0.290；t=-0.098，P=0.922），具有可比性。本研究經(jīng)青島阜外心血管病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 高速離心機(Heraeus Fresco 21)，F(xiàn)luoroskan 熒光酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Pico Green 熒光染料（ 德國Leukocare AG 公司）；流式細(xì)胞儀(BD-FACS Calibur)及配套試劑（美國BD 公司）；BC-5390 血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療公司）；PHILIPS iE33 多普勒超聲診斷儀（上海歐啟電子科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 資料收集及生化指標(biāo)測定：收集IE 患者和對照組的一般臨床資料，包括性別、年齡、病因，采用血細(xì)胞分析儀測定外周血白細(xì)胞(white blood cell，WBC)計數(shù)，中性粒細(xì)胞(neutrophil，NEUT)比例等指標(biāo)。采用超聲心動圖檢測患者左心室舒張期末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)等。

1.3.2 外周血游離DNA/中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)陷阱（cf-DNA/NETs）水平和T 細(xì)胞水平表達檢測：IE 患者于入院次日，對照組于體檢當(dāng)日采集空腹肘靜脈血各6 ml，置于EDTA 真空采血管中，室溫靜置10 min 后進行離心(3 000r/min，10 min)，取上層血漿，-80℃保存?zhèn)溆?。室溫解凍血漿樣本，取100μl 血漿注入血培養(yǎng)瓶，加入PicoGreen 熒光染料避光孵育5 min 后，接種于96 孔板內(nèi)，采用熒光酶標(biāo)儀檢測樣本熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算cf-DNA/NETs 水平。采用流式細(xì)胞儀檢測T 淋巴細(xì)胞亞群CD3+，CD4+，CD8+，計算CD4+/CD8+，檢測方法嚴(yán)格按照說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)數(shù)據(jù)以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用獨立樣本的t檢驗比較兩組血漿NETs水平和T 細(xì)胞表達水平之間的差異；采用Pearson相關(guān)性檢驗分析IE 患者血漿NETs 水平與T 細(xì)胞水平表達的相關(guān)性；采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析血漿NETs 水平對IE 患者死亡的預(yù)測價值，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者生化指標(biāo)及T 細(xì)胞水平表達比較見表1。IE 組患者cf-DNA/NETs，WBC，NEUT，hs-CRP，CD3+，CD4+和CD4+/CD8+水平均顯著高于對照組健康人群，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；IE 患者血清Alb 和CD8+水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；兩組血紅蛋白、LVEDD 和LVEF 比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 兩組患者生化指標(biāo)及T 細(xì)胞水平表達比較（±s）

表1 兩組患者生化指標(biāo)及T 細(xì)胞水平表達比較（±s）

注：WBC：白細(xì)胞計數(shù)；NEUT：中性粒細(xì)胞；Hb：血紅蛋白；Alb：清蛋白；hs-CRP：超敏C-反應(yīng)蛋白；LVEDD：左心室舒張期末內(nèi)徑；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)。

項 目IE 組（n=53）對照組（n=50）t 值P 值cf-DNA/NETs(μg/L)465.15±146.38135.76±37.5218.0930.000 WBC(×109/L）16.14±5.366.24±1.5311.0360.000 NEUT(%)75.42±10.2562.28±6.457.3520.000 Hb(g/L)138.45±12.51142.56±13.23－1.1430.256 Alb(g/L)35.38±10.7542.15±9.78－4.0390.000 hs-CRP(g/L)39.38±10.752.37±1.0422.9600.000 LVEDD(mm)56.62±12.1855.47±10.250.5220.603 LVEF(%)52.16±5.7253.41±6.39－1.8500.067 CD3+(%)66.23±6.7454.21±5.139.5050.000 CD4+(%)44.35±4.2635.14±3.5210.2980.000 CD8+(%)23.75±3.6826.75±3.66－4.9610.000 CD4+/CD8+1.65±0.431.34±0.335.2890.000

2.2 IE 患者NETs 水平與T 細(xì)胞水平表達及預(yù)后的相關(guān)性分析 根據(jù)IE 患者預(yù)后情況分為存活組（29例）和死亡組（24 例），死亡組患者cf-DNA/NETs水平為611.46±102.15μg/L，存活組患者cf-DNA/NETs 水平為407.53±76.49μg/L，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.007，P＜0.01)。Pearson 相關(guān)性分析顯示：IE 患者血漿cf-DNA/NETs 水平與CD8+水平和死亡呈正相關(guān)（r=0.282, 0.352，P=0.041, 0.048），與CD3+，CD4+和CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)（r=-0.424，-0.535，-0.32，P=0.002, 0.000,0.016）。

2.3 外周血NETs 水平對預(yù)后的價值分析 見圖1。以IE 患者入院治療為研究起點，以患者痊愈出院、死亡或出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥為研究終點，繪制ROC 曲線。結(jié)果顯示，外周血NETs 水平對預(yù)測IE 死亡有參考意義（P＜0.05）。NETs 預(yù)測IE 患者死亡的曲線下面積為0.736（95%CI：0.684～0.829，P＜0.01），預(yù)測敏感度、特異度分別為81.29%，75.35%。

3 討論

感染性心內(nèi)膜炎（IE）是死亡率高達15%～20%的感染性疾病，其典型生物學(xué)特征是贅生物的形成，贅生物主要由大小不等、形狀不一的血小板和纖維素團塊組成，內(nèi)含大量病原微生物。贅生物定植于受損的心瓣膜內(nèi)膜（天然瓣膜IE）或心內(nèi)假體（假體IE）上，不僅可造成瓣膜周圍組織破壞，贅生物脫落還可導(dǎo)致血管栓塞、猝死及心力衰竭等[11]。

圖1 外周血NETs 水平預(yù)測IE 預(yù)后的ROC 曲線

炎癥反應(yīng)是IE 最基礎(chǔ)、最關(guān)鍵的病理改變。病原菌的繁殖及內(nèi)毒素的釋放可激發(fā)機體白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的釋放以強化對病原菌的吞噬和清除能力[12]。還可以刺激機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致相關(guān)炎癥指標(biāo)迅速升高[13]。本研究中IE 組患者WBC，NEUT，hs-CRP 等常規(guī)炎癥指標(biāo)水平顯著高于對照組。中性粒細(xì)胞是宿主防御病原體的第一道防線，能夠通過趨化、吞噬、氧化應(yīng)激、形成NETs 等方式捕獲和殺死微生物[14]。NETs是一種由染色質(zhì)和顆粒肽結(jié)合形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，NETs 可被真菌、細(xì)菌、病毒等多種微生物激活，由中性粒細(xì)胞分泌并釋放至胞外，從而固定和清除微生物，并激活其他免疫細(xì)胞、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[15-16]。目前認(rèn)為，NET 捕獲、黏附病原體主要依賴于三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而殺滅病原體依賴于抗菌蛋白[17]。NETs 的形成是由致病菌在全身血液感染中誘導(dǎo)的，既往研究表明，NET 內(nèi)容物可在組織感染部位含量顯著升高。已有研究發(fā)現(xiàn)，在IE 患者的膿毒性血栓，檢測到NETs[18]。本研究分析IE 患者外周血NETs 水平，結(jié)果顯示與健康人群相比，IE患者外周血NETs 水平顯著升高，證實血漿NETs與感染相關(guān)。IE 患者死亡組NETs 水平顯著高于存活組，ROC 曲線結(jié)果顯示，NETs 預(yù)測IE 患者死亡的曲線下面積為0.736，結(jié)果提示，外周血NETs 水平與IE 患者預(yù)后不良密切相關(guān)。

免疫功能的改變在IE 患者中有重要作用，CD3+，CD4+，CD8+是重要的 T 淋巴細(xì)胞，其中CD3+細(xì)胞水平代表機體整體細(xì)胞免疫狀態(tài)[19]，CD4+主要發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能，通常被稱為輔助性 T 淋巴細(xì)胞[20]，而CD8+具有抑制免疫功能的作用，可抑制CD4+細(xì)胞及B 細(xì)胞功能，被稱為抑制性 T 淋巴細(xì)胞[21]。對IE 患者外周血T 淋巴細(xì)胞亞群各個指標(biāo)進行檢測，可較為準(zhǔn)確地反映患者當(dāng)時的免疫狀態(tài)，本研究結(jié)果顯示IE 患者CD3+，CD4+和CD4+/CD8+水平均低于對照組，CD8+水平高于對照組（P＜0.05），表明IE 患者存在免疫功能降低。另外，研究發(fā)現(xiàn)IE 患者外周血中NETs水平與T 細(xì)胞表達水平相關(guān)，與CD8+呈正相關(guān)（P＜0.05），與CD3+，CD4+和CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。這符合NETs 為廣義的致病性DNA 復(fù)合物的定義，機體的炎癥狀態(tài)與NETs 水平相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明IE 患者外周血NETs水平顯著升高，其水平變化與T 細(xì)胞表達水平密切相關(guān)，與IE 患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。但本研究也有一定的局限性，首先，研究樣本量較少，由此可能帶來結(jié)果的偏倚，還需要大樣本、多中心研究以驗證本結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，本研究未剖析IE 患者外周血NETs 水平升高具體機制，這些仍需要進一步研究證實。