類風濕關(guān)節(jié)炎患者血清生長停滯特異性蛋白6表達水平與疾病活動度的相關(guān)性研究

王 瑤，楊 彪，丁 瑩，徐小華，李 卓

（西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院a.檢驗科；b.骨科，西安 710077）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種主要以關(guān)節(jié)滑膜炎為臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1%[1]。生長停滯特異性蛋白6（growth arrest-specific protein 6, Gas6）是一種分泌型蛋白，屬于維生素K 依賴性蛋白家族成員[2]。已有研究表明，Gas6 與糖尿病、動脈粥樣硬化、急性心肌梗死等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示Gas6 參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[3-4]。RA 的確切發(fā)病機制較復(fù)雜，炎癥因子學(xué)說在RA 的進展中起了重要作用[5]，但國內(nèi)外有關(guān)Gas6 在RA 中的臨床研究報道較少。因此，本研究通過對血清Gas6 濃度變化與RA 的相關(guān)性進行分析，探討Gas6 在RA 中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選擇2020年4月～2021年4月在西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院或門診就診的RA 患者102 例作為RA 組，其中男性30 例，女性72 例，年齡49.3±13.8 歲，診斷符合2010年美國風濕學(xué)會（American College of Rheumatology, ACR）修訂的RA 診斷標準[6]，排除標準：①伴有糖尿病、血液病及腫瘤等疾病的患者；②伴有嚴重器質(zhì)性病變的患者；③伴有其他自身免疫性疾病的患者；④需采取非常規(guī)治療的患者；⑤病情加重的患者。選擇同期健康體檢者共98 例作為健康對照組，其中男性25 例，女性73 例，年齡45.4±12.1 歲，與RA組的年齡、性別相匹配，均無自身免疫性疾病、骨及關(guān)節(jié)相關(guān)性病變。本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準。本研究采用回顧性分析，已申請豁免患者知情同意。

1.2 試劑與儀器 Multiskan FC 型酶標儀[賽默飛世爾（上海）有限公司]，BNP 全自動特定蛋白儀[西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]，Lifotronic 全自動特定蛋白儀（深圳普門科技股份有限公司），i2000sr 全自動免疫分析儀（美國雅培公司），AU5800 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司），SRS20/Ⅱ血沉儀（德國VACUETTE公司），Gas6 測定試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：于清晨空腹采集5 ～6ml 靜脈血，紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate ，ESR)用3.8g/dl 枸櫞酸鈉抗凝管，其余項目用帶分離膠的促凝管，3 500r/min 離心10min。BNP 全自動特定蛋白儀檢測類風濕因子（rheumatoid factor，RF)水平，SRS20/Ⅱ血沉儀檢測ESR 水平，Lifotronic 全自動特定蛋白儀檢測C 反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，i2000sr 全自動免疫分析儀檢測抗CCP 抗體水平，AU5800 全自動生化分析儀檢測補體C1q 水平。剩余標本于-80℃凍存，統(tǒng)一檢測Gas6。

1.3.2 血清Gas6 水平檢測：Gas6 為雙抗體夾心ELISA 法，嚴格按照試劑說明書完成操作。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(A)值，通過標準曲線計算各標本的濃度。

1.3.3 RA 患者臨床資料收集：包括年齡、性別、病程及骨關(guān)節(jié)X 線資料，參照中華醫(yī)學(xué)會風濕病分會的《類風濕關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》[7]，根據(jù)關(guān)節(jié)破壞程度，將其分為四期（Ⅰ～Ⅳ）。

1.3.4 RA 患者分組：所有RA 患者按照疾病活動性評分28(Disease Activity Score，DAS28)的評分標準[8]進行評分，將其分為四組：穩(wěn)定期組25例（DAS＜2.6分），輕度活動期組28 例（2.6 分≤DAS＜3.2 分），中度活動期組24 例（3.2 分≤DAS＜5.1 分），重度活動期組25 例（DAS ≥5.1 分）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0 軟件。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)[M(P25, P75)]表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；相關(guān)性分析使用Spearman分析；應(yīng)用ROC 曲線分析Gas6 檢測的診斷效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 組和健康對照組各檢測指標比較 見表1。RA 組的RF，ESR，CRP，抗CCP 抗體，補體C1q，Gas6 水平均高于健康對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

表1 RA 組和健康對照組各檢測指標比較 [M(P25, P75)]

2.2 RA 組不同活動度分期各檢測指標比較 見表2。重度活動期組Gas6 水平高于穩(wěn)定期組和輕度、中度活動期組（Z=-4.82，-4.02，-2.06，均P＜0.05），同時中度活動期組顯著高于穩(wěn)定期組（Z=-3.14，P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 RA 組不同活動度分期各檢測指標比較 [M(P25, P75)]

2.3 RA 組不同關(guān)節(jié)侵蝕分期各檢測指標比較 見表3。Gas6 水平在不同關(guān)節(jié)侵蝕程度分期（Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期）患者間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且Ⅱ期Gas6 水平高于Ⅰ期Gas6 水平（Z=-2.27，P＜0.05），Ⅲ～Ⅳ期Gas6 水平高于Ⅱ期Gas6 水平（Z=-3.57，P＜0.05）。這表明Gas6 水平與關(guān)節(jié)侵蝕程度分期密切相關(guān)。

表3 RA 組不同關(guān)節(jié)侵蝕分期各檢測指標比較 [M(P25, P75)]

2.4 血清Gas6 與各檢測指標的相關(guān)性分析 在Spearman 相關(guān)性研究中，RA 患者的血清Gas6 水平與RF（r=0.303，P＜0.01），ESR（r=0.250，P=0.012），CRP（r=0.276，P＜0.01）和抗CCP抗體（r=0.401，P＜0.01）呈正相關(guān)，其中Gas6與抗CCP 抗體的相關(guān)性最強，與補體Cq（r=0.188，P=0.059）無相關(guān)性。

2.5 血清Gas6 與各指標單獨或聯(lián)合檢測對RA 的診斷價值 見圖1，表4。血清RF，ESR，CRP，抗CCP 抗體，補體C1q 和Gas6 診斷RA 的ROC曲線下面積（AUC）分別為 0.937, 0.911, 0.720, 0.953,0.696 和0.808。 抗CCP 抗體單獨檢測對RA 的診斷敏感度最高（96.6%），特異度也處于較高水平（87.5%）；Gas6 單獨檢測對RA 的診斷特異度最高（92.7%），但敏感度較低（53.4%）。若6 項聯(lián)合檢測，其曲線下面積（AUC）為0.979，敏感度和特異度分別為96.8%和97.9%，均高于其他單獨檢測各組。

圖1 血清Gas6 與各指標單獨或聯(lián)合檢測診斷RA 的ROC 曲線

3 討論

TAM 受體（Tyro3,Axl 和Mer 受體酪氨酸激酶簡稱）家族是酪氨酸激酶家族的重要成員，Gas6 是它們的共同配體，可激活TAM 家族的受體成員[9]。有研究認為，Gas6 有類似CRP 的價值和作用，屬于一種急性時相反應(yīng)蛋白[10]。Gas6 可抑制脂多糖誘導(dǎo)的單核細胞和巨噬細胞釋放的腫瘤壞死因子（TNF-α），IL-1 和IL-6，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[11]。在小鼠體內(nèi)，Gas6 能加速和促進血液循環(huán)中白細胞和血小板對內(nèi)皮細胞的活化，促進白細胞滲出、血栓形成和小鼠炎癥模型[12]。

表4 血清Gas6 與各指標單獨或聯(lián)合檢測對RA 診斷價值

臨床上，RA 的主要特征是骨和軟骨的進行性和不可逆的侵蝕，滑膜炎癥是重要的病理表現(xiàn)，滑膜可分泌多種細胞因子，誘導(dǎo)炎癥細胞浸潤，引起滑膜增厚和慢性炎癥[13]。Gas6 與多種炎癥相關(guān)，如血栓性炎癥、感染性炎癥以及自身免疫性炎癥等[14-15]。因此，本研究猜想Gas6 可能與RA 的風險具有相關(guān)性，并將Gas6 按照RA 不同分期進行統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA 不同分期患者血清Gas6 水平顯著升高，與RA 疾病活動度高度相關(guān)。炎癥穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子的損害對維持病變滑膜內(nèi)免疫細胞和基質(zhì)細胞的持續(xù)浸潤和激活至關(guān)重要[11]，這可能是RA患者體內(nèi)Gas6 升高的機制之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Gas6 水平與關(guān)節(jié)侵蝕程度分期密切相關(guān)。關(guān)節(jié)侵蝕是RA 的一個重要特征，反映了累積的骨損傷。當關(guān)節(jié)侵蝕發(fā)生時，預(yù)示著更高的殘疾率和死亡率[16]。有關(guān)Tyro3 在關(guān)節(jié)炎中的作用的數(shù)據(jù)表明[5]，它的激活對關(guān)節(jié)是有害的，因為它介導(dǎo)滑膜肥大并增加侵蝕負擔。Gas6 以Tyro3依賴的方式誘導(dǎo)滑膜成纖維細胞增殖和破骨細胞分化，Tyro3 是關(guān)節(jié)炎過程中滑膜增生、破骨細胞分化和骨侵蝕的重要信號，Gas6 和Tyro3 構(gòu)成了抑制滑膜增生和相關(guān)骨侵蝕的治療靶點。

由于傳統(tǒng)診斷指標RF 的特異度低，2010年ACR 與歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）聯(lián)合制定了RA 診斷分類的新標準[17]，將抗CCP 抗體列為新的血清學(xué)標志物。有研究提出抗CCP 抗體較RF 出現(xiàn)更早，抗CCP 抗體陽性患者關(guān)節(jié)損害更嚴重、預(yù)后較差，其已成為診斷早期RA 和侵蝕性關(guān)節(jié)損害的特異性指標[18]。抗CCP 抗體檢測產(chǎn)品已發(fā)展到第三代（CCP3），CCP2 和CCP3 聯(lián)合檢測雖然可以提高RA 的診斷，但單獨檢測兩者并無顯著差異。因此，第二代CCP2 是最常見的，雖然它具有高特異度和高靈敏度，但仍有20%～30%的RA 患者抗CCP2 抗體呈陰性[2]。本研究中，抗CCP 抗體的敏感度和特異度均高于RF，與以往研究結(jié)果相一致[2,18]，但Gas6 也呈現(xiàn)出了較好的特異度（92.7%），其聯(lián)合檢測有利于提高實驗室檢查對RA 的輔助診斷。血清Gas6 對RA 的診斷和預(yù)后評估可能密切相關(guān)。

綜上所述，RA 患者血清Gas6 濃度顯著升高，其水平與RA 的發(fā)生和進展呈正相關(guān)。Gas6 水平的升高對RA 的早期診斷、治療監(jiān)測及疾病預(yù)警有重要作用。本研究的不足之處在于：單中心的臨床研究，患者按嚴重程度分組后例數(shù)較少，可能存在選擇性偏差。后期研究有必要擴大樣本量或進行多中心合作，深入研究Gas6 參與RA 發(fā)生及進展的具體機制。