海藻玉壺湯調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯后修飾抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖的機制研究

張鳳暖，高天舒

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧沈陽 110000）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）屬于分化型甲狀腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC），是甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）中最常見的組織學類型，約占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%～90%［1］，大部分DTC 對手術(shù)、131I 殘甲消融和TSH 抑制治療反應良好，可長期生存，5 年生存率可達98%［2］。但是約23%的DTC 患者會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其中約1/3 在其自然病程或治療過程中逐漸表現(xiàn)出聚碘能力下降，對放射性131I 治療不敏感，發(fā)展為放射性碘難治性分化型甲狀腺癌［3］（radioiodine refractory differentiated thyroid cancer， RAIRDTC），是臨床治療的難點，10 年生存率下降至10%［4］。BRAFV600E基因突變是PTC 最常見的突變位點，是RAIR-DTC 形成的重要分子基礎(chǔ)之一［5，6］。BRAF 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑關(guān)鍵激活因子之一，BRAFV600E基因15 號外顯子上第600 位的氨基酸——纈氨酸（V）突變?yōu)楣劝彼幔‥），導致MAPK 通路持續(xù)激活，刺激PTC 細胞增殖和RAIR-DTC形成［7］。

甲狀腺癌屬中醫(yī)“石癭”范疇，《三因極一病證方論》“堅硬不可移者，名曰石癭。”《外科正宗》記載“夫人生癭瘤之癥，非陰陽正氣結(jié)腫，乃五臟瘀血、濁氣、痰滯而成?！鼻宕夺t(yī)宗金鑒》言“石癭海藻玉壺湯主之”，海藻玉壺湯（HYD）首見于明·陳實功《外科正宗》，距今400 余年，是治療癭瘤的名方。海藻玉壺湯由海藻、貝母、陳皮、昆布、青皮、川芎、當歸、半夏、連翹、甘草、獨活、海帶組成，具有化痰軟堅、理氣消癭的作用。

研究顯示，PTC 術(shù)后在TSH 抑制治療基礎(chǔ)上加用海藻玉壺湯，能有效改善甲狀腺功能，降低Tg［8］；海藻玉壺湯能顯著抑制實驗性TC 荷瘤小鼠趨化因子受體CXCR4 基因及蛋白表達減緩腫瘤進展［9］。海藻玉壺湯還可通過影響細胞周期、誘導凋亡抑制實驗性肝癌增殖［10］，通過降低胸腺淋巴瘤小鼠全血黏度和紅細胞聚集，緩解痰凝血瘀體征，抑止腫瘤進展［11］。以上研究均提示海藻玉壺湯可能從多方面多角度發(fā)揮抗癌作用。本團隊前期研究顯示海藻玉壺湯及其拆方可降低實驗性低碘甲狀腺腫大鼠甲狀腺組織氧化應激反應［12，13］，促進NIS蛋白表達［14］，并且富碘中藥與無機碘的作用存在差異［15］。但是，國內(nèi)外對海藻玉壺湯在PTC 中的應用研究尚少，因此開展本研究。

本研究選擇PTC 中最常見的致癌基因——BRAFV600E突變驅(qū)動的PTC 細胞系BCPAP 細胞為研究對象，通過體外實驗，初步評估海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞增殖的抑制作用，為深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與實驗動物

1.1.1 細胞株 人甲狀腺乳頭狀癌細胞BCPAP，人正常甲狀腺細胞Nthy-ori3-1，購自中國科學院上海細胞庫。含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2 實驗動物 健康雌性SPF 級SD 大鼠40 只，6～8 周齡，體質(zhì)量190～220 g，動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥物與試劑

海藻玉壺湯湯劑制備：海藻15 g、昆布15 g、海帶7.5 g、浙貝母15 g、半夏15 g、青皮15 g、陳皮15 g、川芎15 g、當歸15 g、連翹15 g、甘草15 g、獨活15 g，購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房。以上藥物加水浸泡2 h，煎煮3 次，每次煎煮40 min，合并3 次煎煮液后濃縮成含生藥2 g/mL，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1640 培養(yǎng)基（貨號：31800-014），購自美國Gibco 公司；胎牛血清（貨號：04-001-1ACS），購自美國BI；BRAFV600E抑制劑PLX4032（貨號：HY-12057），購自美國MCE 公司；KIO3（貨號：P116291），購自中國Aladdin 公司；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK，貨號：WL02195），購自中國wanleibio 公司；磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK，貨號：WLP1512），購自中國wanleibio 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：WLA004），購自wanleibio 公司；ECL 發(fā)光液（貨號：WLA003），購自wanleibio 公司；PVDF 膜（貨號：IPVH00010），購自美國Millipore 公司；MTT（貨號：KGA311），購自美國凱基。

1.3 含藥血清的制備

40 只健康雌性SD 大鼠，隨機分為中藥組和空白對照組，每組20 只。中藥組按體表面積比換算給藥劑量，生藥含量15.5 g/kg，日2 次灌胃；空白對照組給予等體積去離子水。連續(xù)灌胃1 周，末次給藥后1 h，常規(guī)麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min 分離血清，同組樣本混合后，0.22 μm 濾器過濾除菌，56 ℃滅活30～40 min，-80 ℃保存。

1.4 主要儀器設(shè)備

倒置相差顯微鏡（AE31）；酶標儀（ELX-800）；雙垂直蛋白電泳儀（DYCZ-24DN）；轉(zhuǎn)移槽（DYCZ-40D）；凝膠成像系統(tǒng)（WD-9413B）。

1.5 實驗分組及干預措施

體外實驗分為6 組，A：正常對照組（人正常甲狀腺細胞Nthy-ori3-1+空白血清）；B：模型對照組（BCPAP 細胞+空白血清）；C：PLX4032 組（BCPAP 細胞+空白血清+0.1 μmol/L PLX4032［16］）；D：HYD 組（BCPAP 細胞+20%HYD 含藥血清）；E：HYD+PLX4032 組（BCPAP 細胞+20%HYD含藥血清+0.1 μmol/L PLX4032）；F：高碘水組（BCPAP 細胞+空白血清+13.4 μg/mL KIO3）。

1.6 MTT 法檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的Nthy-ori3-1、BCPAP 細胞，胰酶消化后，調(diào)節(jié)細胞密度2×106個/mL，接種于96孔板，按實驗分組加藥處理，每組設(shè)計5 個復孔，接種后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細胞分別于培養(yǎng)8、24、72 h，加入50 μL 1×MTT，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去上清，加入150 μL DMSO 溶解細胞形成的紫色結(jié)晶，在酶標儀上測定其在570 nm 處OD 值。

1.7 Western blot 檢測ERK、pERK

裂解液抽提總蛋白，BCA 法進行蛋白質(zhì)定量，蛋白樣品20 μL 加入到SDS-PAGE 凝膠中進行電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)印至PDVF 膜上，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，一抗，4 ℃過夜。TBST 漂洗4 次，加入二抗室溫孵育45 min，TBST 漂洗6 次后，滴加ECL 顯影液，凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞增殖活性的影響

MTT 檢測結(jié)果顯示，海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞增殖抑制作用隨時間推移逐漸呈現(xiàn)。8 h 時各組間增殖活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與正常對照組比較，模型對照組在24、72 h 時BCPAP 細胞增殖活性顯著增強（P＜0.05）；24 h 時，PLX4032 組、20%HYD 組、HYD+PLX4032 組均對BCPAP 細胞增殖顯示出抑制趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；72 h 時，與模型對照組比較，PLX4032 組、20%HYD 組、HYD+PLX4032 組細胞增殖活性顯著被抑制（P＜0.05），高碘水組與模型對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與高碘水組比較，PLX4032 組、20%HYD 組、PLX4032+20%HYD 組細胞增殖活性顯著被抑制（P＜0.05），見表1，不同組別隨時間變化增殖活性趨勢見圖1。

圖1 海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞增殖活性的影響Fig 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells

表1 海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞增殖活性的影響（n=5，±s）Tab 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells（n=5，±s）

表1 海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞增殖活性的影響（n=5，±s）Tab 1 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on proliferation activity of BCPAP cells（n=5，±s）

注：與正常對照組比較：*P＜0.05；與模型對照組比較：△P＜0.05；與高碘水組比較：#P＜0.05。

組別細胞增殖活性（OD 值）8 h24 h72 h.186±0.0310.252±0.0320.435±0.080 0.638±0.078*0.407±0.067△#0.387±0.045△#0.328±0.032△#0.599±0.046*20.870 0.000正常對照組模型對照組PLX4032 組20% HYD 組HYD+PLX4032 組高碘水組FP 0 0.216±0.031 0.206±0.023 0.207±0.021 0.195±0.022 0.211±0.036 0.793 0.565 0.333±0.031*0.292±0.036 0.288±0.033 0.265±0.030 0.315±0.037 4.118 0.008

在抑制BCPAP 細胞增殖的作用上海藻玉壺湯含藥血清與PLX4032 具有協(xié)同增效作用（F=10.87，P=0.005）。

2.2 海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達的影響

Western Blot 結(jié)果顯示各組間ERK1/2 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但各組間p-ERK1/2 蛋白表達存在顯著差異（P＜0.05）：與正常對照組比較，模型組p-ERK1/2 蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，PLX4032 組、20%HYD 組、HYD+PLX4032 組p-ERK1/2 蛋白表達顯著下降（P＜0.05），高碘水組與模型對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），圖2A 為Western Blot條帶，圖2B 為條帶灰度分析對比直方圖。

圖2 海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞ERK、p-ERK 蛋白表達的影響Fig 2 Effect of Haizao Yuhu decoction containing serum on the expression of ERK and p-ERK proteins in BCPAP cells

表2 BCPAP 細胞增殖析因設(shè)計方差分析（±s）Tab 2 Analysis of variance of factorial design for BCPAP cell proliferation（±s）

表2 BCPAP 細胞增殖析因設(shè)計方差分析（±s）Tab 2 Analysis of variance of factorial design for BCPAP cell proliferation（±s）

干預因素HYD PLX4032 HYD*PLX4032增殖活性0.387±0.045 0.407±0.067 0.328±0.032 F P 40.01 30.90 10.87 0.000 0.000 0.005

3 討論

海藻玉壺湯是治療癭瘤的名方，并在PTC 以及多種癌癥中顯示出抑制癌細胞增殖，延緩腫瘤進展的作用［7-10］。本研究選用帶有BRAFV600E突變遺傳背景的PTC 細胞系BCPAP 細胞為研究對象，使用含藥血清加藥方式給予體外干預。中藥復方以含藥血清方式添加至細胞中，利用了生物體對中藥復雜成分的代謝和濾過，能夠反映中藥在機體內(nèi)經(jīng)消化吸收產(chǎn)生藥效的真實情況［17，18］。選擇20%海藻玉壺湯含藥血清，以8、24、72 h 作為觀察時點開展海藻玉壺湯對BCPAP 細胞增殖抑制研究。選擇PLX4032 作為陽性對照藥，PLX4032 又名Vemurafenib，是B-Raf 酶抑制劑。海藻玉壺湯為富碘中藥復方，海藻、昆布、海帶為富碘中藥［19，20］，因此在本研究中特設(shè)置與海藻玉壺湯相同碘含量的KIO3水組作為對照，用于解釋海藻玉壺湯復方作用與單純碘劑的差異。

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERKs）分為 ERK1 和 ERK2，是MAPK 信號通路最終效應因子，主要參與細胞生長與分化。經(jīng)典的ERK 活化通路由細胞外不同刺激配體結(jié)合到細胞膜上的受體酪氨酸激酶，激活GTP蛋白，順序激活RAF、MEK，最終磷酸化ERK 蛋白，促使其活化為p-ERK，進而易位到細胞核，磷酸化細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，促進細胞生長分化。BRAFV600E突變，Raf-MEK-ERK 信號通路持續(xù)激活，刺激細胞增殖和轉(zhuǎn)移，在癌癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用［21］。

本研究顯示BCPAP 細胞增殖活性明顯高于正常甲狀腺細胞，海藻玉壺湯含藥血清干預后，BCPAP 細胞增殖活性被顯著抑制。對MAPK 通路上ERK 蛋白表達的分析顯示，BCPAP 細胞與正常甲狀腺細胞中ERK 蛋白表達無差異，而p-ERK 蛋白表達顯著增加，海藻玉壺湯含藥血清干預后，p-ERK蛋白表達降低，但仍高于正常甲狀腺細胞組，其療效與PLX4032 相當。提示海藻玉壺湯抑制BCPAP細胞增殖的作用可能通過抑制ERK 蛋白磷酸化實現(xiàn)。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活力和功能最基本、最重要的機制，在細胞信號轉(zhuǎn)導中起至關(guān)重要的作用［22］。研究顯示來源于海藻、連翹的槲皮素，來源于青皮、陳皮的川陳皮素和來源于半夏的黃芩素，是海藻玉壺湯的重要活性成分，與PTC 核心靶點具有較強的結(jié)合力，可能對PTC 具有直接的治療作用［23］。槲皮素可以提高H9C2 細胞p-MAPK 和p-ERK1/2 磷酸化水平［24］，Raf 和MEK 蛋白激酶是槲皮素化學預防作用的直接分子靶標［25］。黃芩素可顯著降低甲狀腺未分化癌細胞p-ERK/ERK 比值［26］。川陳皮素與順鉑聯(lián)用可以有效降低甲狀腺未分化癌細胞活力［27］，與索拉非尼有強協(xié)同作用［28］。海藻玉壺湯與PLX4032 合用，有協(xié)同增效作用，海藻玉壺湯能否緩解PLX4032 耐藥性值得深入研究。

海藻玉壺湯是富碘中藥復方［19，20］，一直以來，碘對甲狀腺癌的影響存在較大爭議。大多數(shù)的研究表明碘缺乏是甲狀腺腫瘤啟動和促進因素［29］，糾正碘缺乏癥可能會使甲狀腺癌亞型向惡性程度降低的方向轉(zhuǎn)變［30，31］，但不會影響甲狀腺癌的總體風險［32］。碘過量作為甲狀腺癌的危險因素證據(jù)不足［33］，有限的病例研究提示碘攝入量增加是甲狀腺癌的保護因素［34］，富含碘的食物可能對甲狀腺癌發(fā)生風險起保護作用［32，35］。本研究結(jié)果顯示，與海藻玉壺湯煎劑具有相同碘含量的高碘水組并無抑制BCPAP 細胞增殖和ERK 磷酸化的作用，提示海藻玉壺湯含藥血清抑制BCPAP 細胞增殖可能與富含碘無關(guān)；高碘水組呈現(xiàn)出與模型組相似的增殖狀態(tài)，無過度增殖發(fā)生，這在一定程度支持海藻玉壺湯中所含劑量碘不是甲狀腺癌的危險因素。

海藻玉壺湯含藥血清對BCPAP 細胞增殖具有抑制作用，其機制可能是通過抑制ERK1/2 蛋白磷酸化這一蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程抑制BCPAP 細胞增殖；海藻玉壺湯含藥血清可能具有協(xié)助增強PLX4032 療效的作用。

作者貢獻度說明：

張鳳暖：實驗設(shè)計、實驗實施及執(zhí)筆；高天舒：實驗設(shè)計、審校。

文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突，該研究未涉及任何廠家或其他經(jīng)濟組織直接或間接經(jīng)濟或利益贊助。