冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白在體外循環(huán)期間導(dǎo)致急性腎損傷機制實驗研究

范 陽，劉展會，豆?jié)凉瑥埼靼?/p>

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安市第九醫(yī)院，陜西 西安 710054)

大多數(shù)心臟手術(shù)都離不開體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass,CPB)。然而，在CPB 過程中，白細胞介素(Interleukin，IL)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、激肽釋放酶和緩激肽等炎癥因子的表達顯著升高[1]，這會加劇CPB過程中的炎性反應(yīng)并導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥[2-3]。其中，急性腎損傷(AKI)與其密切相關(guān)[4-6]，也是最嚴重、最常見的并發(fā)癥之一。從臨床數(shù)據(jù)來看，心血管手術(shù)患者中5%～30%患有AKI，這些患者的病死率明顯升高。同時，也給社會帶來了嚴重的公共衛(wèi)生負擔和巨大的公共資源消耗。

冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白(Cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)屬于冷休克蛋白家族，是在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的第一個冷休克蛋白。它在多種組織中以低水平表達，但在低溫和缺氧等環(huán)境中顯著上調(diào)[7-8]。在缺血再灌注損傷中，CIRP蛋白可以從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，并逐漸釋放到細胞外。細胞外的CIRP可以作為一種新的損傷相關(guān)模式分子(Damage-associated molecular pattern，DAMP)來激活Kupffer細胞并促進炎性反應(yīng)[9]。CPB期間的心肌缺血再灌注可誘導(dǎo)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，而且腎臟的線粒體含量僅次于心臟，是線粒體含量第二豐富的臟器，這可能通過上調(diào)促炎轉(zhuǎn)錄因子引起炎癥并增加AKI的風險[10-12]。Liu等[13]報道CPB患者CIRP水平顯著升高，是術(shù)后AKI的獨立危險因素。另有研究發(fā)現(xiàn)，分泌型CIRP主要通過識別 TLR4-MD2復(fù)合物來產(chǎn)生炎癥因子和趨化因子，從而激活細胞內(nèi)炎癥信號通路，進而引起非特異性炎性反應(yīng)。因此，我們推測在心臟驟停期間可能會分泌大量CIRP，然后在再灌注后釋放到循環(huán)中。這些分泌的CIRP可以作為DAMP誘導(dǎo)全身炎癥并促進AKI的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞：大鼠心肌細胞系H9c2(批號：CL-0089),大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E(批號：CL-0174)。

1.1.2 藥品及試劑：BCA蛋白試測定劑盒(批號：P0012S)；4%多聚甲醛(批號：441244)；DMEM(批號：S9020)；胎牛血清(批號:T8150)；胰蛋白酶(批號:31600)；C23(批號：BP022069)；發(fā)光液(貨號：1705061)；冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白抗體(anti-CIRP，批號：ab191885)；缺氧誘導(dǎo)因子1α抗體(anti-HIF-1α，批號：ab179483)；TOLL樣受體4抗體(anti-TLR-4，批號：ab22048)、髓樣分化初級應(yīng)答基因-88抗體(anti-MyD88，批號：ab133739)、半胱氨酸蛋白酶-3抗體(anti-caspase-3，批號：ab32351)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(anti-GAPDH，批號：ab8245)、DAPI染色試劑(批號：ab104139)；凋亡蛋白bax抗體(anti-bax，批號： ab216494)、凋亡蛋白bcl2抗體(anti-bcl2，批號：ab32124)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號：CASP3C)；0.5% Triton X-100 (批號：0219485483)，1%牛血清白蛋白 (批號：36104ES25)；CIRP檢測試劑盒(批號：SEG886Hu)；IL-6檢測試劑盒(批號：SEA079Ga)；TNF-α檢測試劑盒(批號：SEA133Si)。

1.1.3 主要儀器：超低溫冰箱、細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；紫外分光光度儀(日本島津公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad Laboratories公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：大鼠心肌細胞系H9c2在添加有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細胞接種在6孔板中，每孔密度為5×105個細胞。將細胞分為以下四組：常溫(37 ℃)常氧培養(yǎng)2 h(NN組)，低溫(15 ℃)缺氧(1% O2)培養(yǎng)2 h(HH組)，細胞在低溫和低氧條件下培養(yǎng)2 h，然后在常溫和常氧條件下培養(yǎng)30 min(HHNN組)，在低溫和低氧條件下培養(yǎng)2 h的細胞，加入C23，一種CIRP衍生肽，可阻斷CIRP與其受體結(jié)合，然后在常溫常氧下培養(yǎng)30 min(C23組)。收集不同處理組的培養(yǎng)基。然后將6孔板中密度5×105個/孔的大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E分別與四組培養(yǎng)基在常溫常氧下培養(yǎng)4 h。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡：通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對來自每組的等量蛋白質(zhì)進行電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與一抗在4 ℃孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，并在37 ℃下孵育1 h。本研究中使用的抗體是 anti-CIRP、anti-HIF-1α、anti-TLR-4、anti-MyD88、anti-Caspase-3 (1∶1000)、anti-bax、anti-bcl2 (1∶1000)，anti-GAPDH(1∶3000)。使用發(fā)光液檢測蛋白質(zhì)并通過成像系統(tǒng)觀察。

1.2.3 免疫熒光：免疫熒光染色，H9c2細胞在12孔板中生長到80%左右匯合，根據(jù)分組進行不同的處理。細胞用PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定，用0.5% Triton X-100滲透。細胞用1%牛血清白蛋白封閉，并用anti-CIRP(1∶100) 在4 ℃過夜。然后將樣品與二抗在37 ℃下孵育1 h，并用DAPI復(fù)染。C23被綠色熒光蛋白標記，進入細胞后即可表達，使用熒光顯微鏡對細胞進行成像。

1.2.4 TUNEL染色：為了在孵育后檢測凋亡的NRK-52E細胞，按照制造商的方案進行了TUNEL染色。完成所有程序后，用DAPI對標本進行復(fù)染。與沒有DNA片段化而顯示藍色核染色的細胞形成對比，當染色為紅色時鑒定為凋亡細胞核。TUNEL測定是通過對每個樣本5個圖像上的3個獨立樣本的細胞計數(shù)來量化，然后使用單個樣本的算術(shù)平均值進行統(tǒng)計評估。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)：按分組進行不同處理后，收集H9c2和NRK-52E細胞培養(yǎng)基作為待測標本。使用ELISA 試劑盒測定 CIRP、IL-6、TNF-α的水平。所有測定均根據(jù)制造商的說明進行。實驗獨立重復(fù)3次。H9c2細胞培養(yǎng)后與NRK-52E細胞培養(yǎng)后IL-6和TNF-α濃度的差異計算為ΔIL-6和ΔTNF-α。

2 結(jié) 果

2.1 低溫缺氧促進心肌細胞分泌CIRP 為模擬心臟手術(shù)中心肌缺血再灌注的過程，將H9c2細胞在15 ℃、1% O2條件下培養(yǎng)2 h，然后在常溫常氧條件下培養(yǎng)30 min。結(jié)果表明HH組和HHNN組HIF-1α的表達高于NN組。HHNN組CIRP的表達也顯著高于NN組，而CIRP在C23組和NN組的表達相似。TLR-4和MyD88的表達趨勢與CIRP一致(圖1A)。免疫熒光染色顯示，NN組、HH組和HHNN組CIRP表達依次升高，但C23組CIRP表達明顯低于HH組和HHNN組(圖1B)。

A:各組CIRP、TLR-4和MyD88蛋白表達情況;B:各組免疫熒光染色(×400)

2.2 低溫缺氧促進心肌細胞炎性因子分泌 低溫和缺氧不僅促進心肌細胞分泌CIRP，而且促進炎癥因子的分泌。各組培養(yǎng)基中CIRP濃度分別為(104.9±23.8) pg/ml、(170.8±20.9) pg/ml、(245.7±33.5) pg/ml和(146.7±26.6) pg/ml(HHNN與NN,P=0.006，HHNN與C23，P=0.018)。此外，各組培養(yǎng)基中IL-6濃度分別為(20.3±2.1) pg/ml、(33.0±1.9) pg/ml、(47.2±4.0) pg/ml和(26.3±2.3) pg/ml(HHNN與NN，P=0.002；HHNN與C23，P=0.003)。各組TNF-α濃度分別為(16.4±3.0) pg/ml、(46.5±4.1) pg/ml、(70.7±5.1) pg/ml和(35.1±3.6) pg/ml(HHNN與NN，P<0.001；HHNN與C23，P=0.001)。

2.3 低溫缺氧心肌細胞分泌CIRP和炎癥因子誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡 CPB期間，心臟再灌注后釋放大量CIRP等炎癥因子。使用低溫缺氧的H9c2細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-52E細胞，模擬CPB后的腎損傷。TUNEL染色表明HH組和HHNN組的凋亡細胞多于 NN 組和 C23 組(圖2A)。四組的凋亡指數(shù)分別為0.92%、5.39%、8.36%和1.97%(HHNN與NN，P=0.013;HHNN與C23，P=0.009;HH與NN，P=0.016，圖2B)。此外，凋亡基因 cleaved caspase-3和bax在HH組和HHNN組中的表達高于NN組和C23組，而凋亡抑制基因bcl-2在HH組和HHNN組中低表達(圖2C)。另外CIRP還刺激了NRK-52E細胞的炎性反應(yīng)。HHNN組TLR-4和MyD88的表達高于NN組和C23組。各組NRK-52細胞分泌的ΔTNF-α濃度分別為(4.9±0.2) pg/ml、(16.5±4.0) pg/ml、(15.7±3.6) pg/ml和(8.8±2.2) pg/ml(HHNN與NN，P=0.034，HH與NN，P=0.038，圖2D)。各組ΔIL-6濃度分別為(8.4±1.5) pg/ml、(9.4±3.0) pg/ml、(12.1±0.7) pg/ml和(7.2±1.0) pg/ml(HHNN與NN，P=0.032;HHNN與C23，P=0.004，圖2E)。

A:各組TUNEL染色(×200)；B：各組細胞凋亡指數(shù)；C：各組相關(guān)因子蛋白表達情況；D、E：各組培養(yǎng)基中△TNF-α、△IL-6濃度。兩者比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

已知細胞內(nèi)CIRP和細胞外CIRP具有不同的功能,細胞內(nèi)CIRP充當RNA伴侶以協(xié)調(diào)與應(yīng)激源相關(guān)的翻譯，而細胞外CIRP充當新的DAMP以促進和放大炎癥級聯(lián)[13]。在許多以無菌炎癥為特征的缺血再灌注模型中，CIRP的血清和組織水平也顯著升高。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈閉塞后小鼠腦中CIRP升高，并隨著缺氧時間增加分泌到細胞外，同時TNF-α表達上調(diào)，而CIRP缺陷小鼠的同一模型中TNF-α的表達和小膠質(zhì)細胞的活化顯著降低。Cen等[15]研究表明，CIRP的缺乏可以減輕炎癥和氧化應(yīng)激，并減輕腎缺血再灌注后的腎損傷。

先前的研究表明，CIRP 與參與NF-κB激活的細胞表面受體TLR4-MD2復(fù)合物具有強結(jié)合力，激活細胞內(nèi)炎癥信號通路產(chǎn)生炎癥因子與趨化因子，進而引起非特異性炎癥反應(yīng)[13]，而 TLR4缺陷小鼠對重組 CIRP 蛋白刺激誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)顯著弱于野生型小鼠。在組織骨折模型中，CIRP 可通過TLR4/MyD88 通路激活 NADPH 氧化酶引起 ROS 釋放，并活化核酸內(nèi)切酶 G 致使線粒體碎片化，最終介導(dǎo)巨噬細胞自噬與程序性壞死[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)心肌細胞在低溫缺氧的情況下會分泌大量的CIRP。一方面，這些CIRP激活心肌細胞的炎癥反應(yīng)，并通過TLR-4/MyD88途徑釋放TNF-α和IL-6。另一方面，分泌的CIRP等炎癥因子作用于腎小管上皮細胞，誘導(dǎo)其凋亡。C23與CIRP 序列全長的15聚體肽重疊，對MD2具有高親和力。它阻斷了CIRP介導(dǎo)的促炎反應(yīng)，減少了對腎小管上皮細胞的損傷。

HIF-1在缺氧環(huán)境中的作用已被廣泛研究。大量信號分子由HIF-1 DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，從而增加細胞氧合并增強對缺氧條件的代謝適應(yīng)。目前關(guān)于缺氧條件下HIF-1α與CIRP關(guān)系的研究較少。Wellmann證明CIRP通過一種不依賴HIF-1的機制在缺氧時適應(yīng)性地表達。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)和體外慢性低壓缺氧條件下，HIF-1α均顯著升高，并介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。然而，CIRP 的過表達抑制了缺氧時 HIF-1α的上調(diào)，并抑制了缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。在我們的研究中，CIRP 和 HIF-1α 的表達在暴露于低溫和缺氧的心肌細胞中增加，并且在C23給藥后HIF-1α和CIRP的表達受到抑制。在癌癥研究中也有類似的結(jié)果。Lu等[18]報道CIRP可以通過結(jié)合其 mRNA 的3’-UTR來誘導(dǎo)HIF-1α的表達，從而增加膀胱癌細胞中 mRNA 的穩(wěn)定性。Yang等[19]還證明HIF-1α是Uni Gene 3’-UTR數(shù)據(jù)庫中 CIRP 靶向轉(zhuǎn)錄物之一。有趣的是，CIRP 的表達在復(fù)溫和復(fù)氧后繼續(xù)增加。在大鼠體外循環(huán)模型中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。CIRP的表達在心跳恢復(fù)后的復(fù)溫階段繼續(xù)增加[20]。相關(guān)機制還有待進一步研究。

綜上所述，心臟手術(shù)過程中，心肌細胞不可避免地需要經(jīng)歷低溫缺氧的過程。我們的研究結(jié)果表明心肌細胞在低溫和缺氧條件下分泌大量CIRP，并在復(fù)溫和復(fù)氧后誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。分泌的CIRP可介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)并促進腎小管上皮細胞凋亡，進一步的結(jié)論需要更多的動物實驗結(jié)果來證明。