復方枇杷葉膏微生物限度檢查法的建立與結果分析

紀開明,朱月輝,高婷婷,方 凌

(1.銅陵市食品藥品檢驗中心,安徽 銅陵 244061; 2.安徽省牡丹產業(yè)工程技術研究中心,安徽 銅陵 244061)

復方枇杷葉膏處方由8味中藥組成(枇杷葉100g、車前草75g、百部15g、苦杏仁15g、桔梗15g、麻黃15g、浙貝母15g、甘草15g),用于風熱咳嗽,咽喉干燥,咯痰不爽[1]。藥品當中的微生物對于產品質量和用藥安全有著很大的影響,對于藥品生產中,做好微生物的檢驗是確保藥品無菌化的主要方式,微生物限度檢查是所有中成藥的必檢項目,對于復方枇杷葉膏應進行需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)和控制菌(大腸埃希菌、沙門菌)檢查方法適用性試驗[2-3]。

微生物限度檢查指檢查非規(guī)定滅菌制劑和原輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包含細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌數(shù)檢查[4-7]。常用抑菌方法有四種,即稀釋法、薄膜法、中和法、離心法,或幾種方法聯(lián)合使用[8],離心法成本相對較低而且方法簡單、有效可操作。

此試驗按照中國藥典通用技術要求生物檢查法,對 12個批次復方枇杷葉膏進行試驗及驗證,并對驗證結果進行數(shù)據(jù)分析,為復方枇杷葉膏的微生物限度方法學驗證奠定了基礎,加強了對復方枇杷葉膏產品的質量把控。

1 材料與方法

1.1 儀器

S25 圓周震蕩器(德國艾卡集團); AB135-S電子天平(瑞士梅特勒公司); GHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱(揚州慧科電子有限公司); 3870ELVC 型立式全自動高壓蒸汽滅菌器(Tuttnauer公司); SPX-150型生化培養(yǎng)箱(揚州慧科電子有限公司)。

1.2 實驗菌株

大腸埃希菌[CMCC(B)44 102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63 501]、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、黑曲霉[CMCC(F)98 003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50 094],以上菌種由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 培養(yǎng)基、試劑

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號:200511)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號: 200821)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號: 200630)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號:200525)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號: 200217)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號: 201015)、RV沙門增菌液體培養(yǎng)基(批號:201118)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號:201009),pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號: 201225)(以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司提供)。

1.4 實驗樣品

復方枇杷葉膏(廣東新功藥業(yè)有限公司、貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司、廣西梧州三箭制藥有限公司三個公司各4批次)。

1.5 實驗方法

1.5.1 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)試驗驗證

1.5.1.1 菌液的制備

菌液A:吸取30℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1mL,加0.9%的無菌氯化鈉溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌懸液,作為活菌計數(shù)用。

菌液B:吸取30℃培養(yǎng)24h的銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1mL,加0.9%的無菌氯化鈉溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌懸液,作為活菌計數(shù)用。

菌液C:吸取30℃培養(yǎng)24h的枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物1mL,加0.9%的無菌氯化鈉溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌懸液,作為活菌計數(shù)用。

菌液D:吸取25℃培養(yǎng)36h的白色念珠菌培養(yǎng)物1mL,加0.9%的無菌氯化鈉溶液,制成含菌不多于100cfu/0.01mL 的菌懸液,作為活菌計數(shù)用。

菌液E:吸取25℃培養(yǎng)168h的黑曲霉培養(yǎng)物適量,加5mL含0.05%聚山梨脂80的0.9%的無菌氯化鈉溶液,洗霉菌孢子,球形吸管取出菌液,用標準比濁管比濁后,稀釋為不多于100cfu/0.01mL 的菌懸液,作為活菌計數(shù)用。

1.5.1.2 樣液的制備

稱取樣品約10 g,加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10的溶液。

1.5.1.3 需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

試驗組:分別取上述五種菌液A、B、C、D、E各0.01mL與1mL供試液混合后加入培養(yǎng)基,按離心法測定其菌數(shù)。

供試品對照組:取供試液1mL與0.01mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液混合后加入培養(yǎng)基,按離心法測定其菌數(shù)。

菌液對照組:分別取上述五種菌液A、B、C、D、E各0.01mL與1mL滅菌pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液混合后加入培養(yǎng)基,按離心法測定其菌數(shù)。

結果計算:回收率=(試驗組的平均菌數(shù)-供試品對照組平均菌數(shù))/菌液對照組平均菌數(shù) ×100%。

1.5.2 控制菌(大腸埃希菌、沙門菌)方法驗證

1.5.2.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)物適量,各接種至5mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,置恒定36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,取培養(yǎng)物1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌不多于100fu/mL的菌懸液,其菌數(shù)在做對照試驗的同時用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基注皿或平板涂布,經培養(yǎng)后計數(shù)確定。

1.5.2.2 樣液的制備

取樣品約10 g,加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量制成1∶10的溶液。

沙門菌檢查的供試液制備:取供試樣品10g,直接接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基200mL中,混勻,培養(yǎng)24小時。

1.5.2.3 驗證方法

取適量供試液及不多于100cfu試驗菌加入到增菌培養(yǎng)基中,按照相應控制菌檢查法進行檢查。

1.5.2.4 結果

假如試驗組檢出試驗菌,那么按照此供試液制備法和控制菌檢查法進行該供試品的控制菌檢查;假如試驗組未檢出試驗菌,那么需按照需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)具抑菌活性的供試品項下操作,以消除供試品的抑菌活性。

1.6 結果與分析

1.6.1 供試液為1∶10 時

復方枇杷葉膏對五種菌種的回收比值都在0.5～2.0之間, 全部沒有明顯的抑菌現(xiàn)象, 結果見下表 1。因此,此試驗方法進行方法適用性試驗可行。

表1 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌的回收比值(n=3)

1.6.2 供試液濃度為 1∶10 時控制菌的結果

表2 控制菌(大腸埃希菌、沙門菌)結果

2 結論與討論

復方枇杷葉膏微生物限度是檢驗中藥制劑是否安全用藥的重要指標之一,復方枇杷葉膏的微生物限度符合《中國藥典》(2020 年版四部)通用技術要求是基本要求,本試驗采用了離心法對其結果各規(guī)定菌株的回收率均可達到《中國藥典》(2020 年版四部)要求[1,9],說明此方法對復方枇杷葉膏的質量控制簡單、有效、可行。

本試驗按《中國藥典》(2020 年版四部)生物檢查法進行3次獨立適用性試驗,為檢驗復方枇杷葉膏的微生物限度方法學驗證奠定了基礎[1,10-12],加強了對復方枇杷葉膏產品質量的把控。