奇異變形桿菌脂多糖抗原的制備及其對小鼠免疫原性、毒性、安全性和保護(hù)性評價

楊文腰，韓鐫竹，廖輝，修雪亮，張建，侯雅丹，周荔葆

1.遼寧成大生物股份有限公司，遼寧 沈陽 110179；2.遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心，遼寧 沈陽 110016

變形桿菌屬是革蘭陰性機(jī)會致病菌，屬于腸道細(xì)菌科，廣泛分布于自然環(huán)境及人類和動物的腸道中［1］。當(dāng)患者免疫功能低下、術(shù)后及燒傷時，臨床上常見的條件致病菌就會引起相關(guān)細(xì)菌感染，尤其是奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）引起的敗血癥，病死率較高，也是泌尿系統(tǒng)感染的主要病原菌［2］。

近些年，隨著廣譜及超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在臨床上廣泛大量使用，導(dǎo)致變形桿菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，耐藥率也逐漸呈上升趨勢，給臨床治療感染性疾病帶來很大困難。于波心等［3］對醫(yī)院臨床分離獲得的266 株P(guān)M 進(jìn)行分布及耐藥性分析，樣本主要來源于尿液（57.89%），陽性檢出率為19.92%。陸玉婷等［4］對250 株P(guān)M 進(jìn)行耐藥性分析，藥敏結(jié)果顯示，PM 對氨芐西林、復(fù)方新諾明、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星耐藥率較高，且大部分具有多重耐藥現(xiàn)象。抗生素的使用不能預(yù)防感染，長期使用抗生素可能引起菌群失調(diào)，引起細(xì)菌多重耐藥性的生產(chǎn)［5］。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是構(gòu)成革蘭陰性菌細(xì)胞外壁的特有成分之一，具有種屬特異性，在革蘭陰性菌感染和疾病演化過程中也具有重要作用，是造成全身性炎癥綜合征的主要原因［6］。本研究通過對經(jīng)純度檢定、種屬鑒別合格的31 株P(guān)M 進(jìn)行菌株耐藥性、毒力、LPS 抗原免疫原性、安全性及毒性等檢測，初步獲得候選株，同時進(jìn)一步對其LPS多價抗原開展保護(hù)性研究，評價候選株是否適用于疫苗的生產(chǎn)，為后續(xù)疫苗生產(chǎn)工藝的研究提供試驗基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株 PM 樣本由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院從我國華南、東南、西北、西南及東北5個地域的三甲醫(yī)院收集，經(jīng)純度檢測、種屬鑒別合格后確定31株樣本符合試驗要求。

1.2 主要試劑及儀器 革蘭染色試劑盒購自美國Sigma 公司；Tergitol-7、營養(yǎng)瓊脂、替卡西米、頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氯霉素、亞胺培南藥敏紙片及M-H 培養(yǎng)基均購自英國Oxoid 公司；API20E 購自法國梅里埃公司；酪蛋白、酵母浸粉、葡萄糖、胰酶等無機(jī)鹽購自國藥控股有限公司；發(fā)酵罐購自德國貝朗醫(yī)療（蘇州）有限公司；超濾膜包購自美國Millipore 公司。

1.3 實驗動物 SPF 級昆明種小鼠，3 周齡，體重16 ～18 g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物合格證號分別為43004700012102、43004-700014310、43004700018079、43004700030707 及43-004700031315；SPF 級豚鼠，體重 260 ～ 280 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號為11400700105438。本實驗均以科研為目的對實驗動物進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照2006年9 月13 日科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（國科發(fā)財字［2006］398 號）。

1.4 抗生素耐藥性測定 選擇7 種常規(guī)抗生素對31株P(guān)M 進(jìn)行抗生素耐藥性試驗，獲取菌株抗生素耐藥性譜圖。分別將預(yù)增菌后的含有PM 的營養(yǎng)肉湯劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h。采用K-B 法對上述菌株進(jìn)行耐藥性測定，將菌懸液涂布于M-H 平板，貼上上述藥敏紙片后放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 ～18 h，測定抑菌圈直徑，結(jié)果評價依據(jù) Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）（2012）參考標(biāo)準(zhǔn)確定菌株屬于敏感（S）、耐受（R）或介于兩者之間（I）。

1.5 菌株毒力測定 通過小鼠半致死量（lethal dose，50%，LD50）對篩選獲得的13 株具有多重耐藥性的PM 進(jìn)行 LD50測定。初始濃度為 8.0 × 109／ mL，用無菌0.9% NaCl 溶液沖洗含有菌株的斜面培養(yǎng)物，倍比稀釋（1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 和 1 ∶512）；取昆明種小鼠 936 只，經(jīng)腹腔注射，0.5 mL ／ 只，每組 8 只，共 9 組，連續(xù)記錄5 ～7 d，統(tǒng)計小鼠死亡情況，并計算LD50，根據(jù)菌株LD50大小確定候選菌株（LD50越小，毒力越大）。

1.6 LPS 抗原的制備

1.6.1 大規(guī)模發(fā)酵罐培養(yǎng) 取確定的PM 進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)液為霍廷格培養(yǎng)基，菌株生產(chǎn)工藝相同。向反應(yīng)器中加入7 ～8 L 培養(yǎng)基，接種細(xì)菌密度為 2.0 × 107個 ／ mL，共 200 mL，設(shè)定主要發(fā)酵參數(shù)：37 ℃，pH 7.2，200 r ／ min，溶氧 30%。培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，細(xì)菌密度達(dá)穩(wěn)定后停止培養(yǎng)。

1.6.2 LPS 抗原收獲時間的優(yōu)化 采用鹽酸羥胺在位萃取法獲得 PM LPS 抗原［7］：按 1 L 菌液中 1 ×109個 ／mL 加入 60 μg 鹽酸羥胺，在 56 ℃條件下設(shè)定通氣量 2 L ／ min、轉(zhuǎn)速 100 r ／ min、pH 7.2，每隔 6 h取樣，檢測LPS 抗原含量，確定最佳萃取時間。

1.6.3 LPS 抗原的純化 在位消化后，采用低溫高速離心法分離菌體，收獲上清液中LPS 抗原、經(jīng)超濾、兩步沉淀法（分別在pH 5.5 和pH 4.3 用75%預(yù)冷乙醇沉淀LPS 抗原）、冷凍干燥等技術(shù)獲得固體抗原，殘留水分不高于5%。

1.7 LPS 抗原含量測定 采用蒽酮-硫酸法測定PM LPS 抗原多糖含量。以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，取6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg ／ mL 6個不同濃度葡萄糖溶液各1 mL，分別與5 mL 蒽酮溶液混合，冰浴和沸水浴各10 min，冷卻后作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，在波長620 nm 處記錄吸光度值。

1.8 LPS 抗原活性測定

1.8.1 免疫原性測定 分別取候選菌株LPS 抗原凍干品，用無菌生理鹽水配制成 300、30、3、0.3 μg ／mL，取昆明種小鼠360 只，10 只／組，對照組為生理鹽水，經(jīng)腹腔注射，0.5 mL ／ 只，免疫 7 d 后進(jìn)行攻菌試驗，攻菌劑量為 6 LD50，注射途徑同上，0.5 mL ／ 只，觀察5 ～7 d，記錄小鼠死亡數(shù)，并計算ED50，應(yīng)低于10 μg ／ mL。

1.8.2 安全性測定 分別取候選菌株LPS 抗原凍干品，用生理鹽水稀釋至 250 μg ／ mL。取豚鼠 18 只，每組注射 2 只，0.5 mL ／ 只，經(jīng)腰部兩側(cè)皮下各注射0.25 mL。注射后1 周內(nèi)每日稱量豚鼠重量并觀察局部反應(yīng)，1 周后3 日稱重并記錄局部反應(yīng)，結(jié)束觀察期。7 d 內(nèi)豚鼠體重下降不超過10%，且觀察期結(jié)束時體重明顯增長即可判定該受試品安全性合格。

1.8.3 毒性測定 分別取候選菌株LPS 抗原凍干品，用無菌生理鹽水配制成 4、2、1、0.5 mg ／ mL。取昆明種小鼠 360 只，經(jīng)腹腔注射，0.5 mL ／只，10 只 ／組，觀察5 ～7 d，統(tǒng)計不同濃度組的死亡情況，并計算LD50值，應(yīng)不低于 0.6 mg ／ mL。

1.9 同一性試驗（Dienes） 采用 Dienes 試驗［8］對1.8.3 項試驗選擇的PM 進(jìn)行分型研究，選擇的PM分別交叉配對，每2 株細(xì)菌間隔一定的距離點種于同一營養(yǎng)瓊脂平板上，共計15 組，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h，觀察結(jié)果。菌株相互蔓延生長至相近處兩菌苔出現(xiàn)明顯分界線，即細(xì)菌產(chǎn)生拮抗，進(jìn)一步說明菌株不是同一菌株。

1.10 LPS 多價抗原保護(hù)性試驗

1.10.1 侯選菌株保護(hù)性試驗 分別取1.8.3 項選擇的候選菌株LPS 抗原凍干品，按1 ∶1 比例混合并調(diào)節(jié)終濃度為50 μg ／ mL。取昆明種小鼠 120 只，隨機(jī)分為試驗組和對照組，每組60 只。試驗組注射LPS 多價抗原，對照組注射生理鹽水。7 d 后分別經(jīng)腹腔注射對應(yīng)菌株，攻菌劑量為3 LD50，每組10 只，觀察5 ～7 d，記錄小鼠死亡數(shù)，并計算多價抗原對候選株的保護(hù)性，應(yīng)不低于70%。

1.10.2 其他菌株保護(hù)性試驗 分別取1.8.3 項選擇的候選菌株LPS 抗原凍干品，按1 ∶1 比例混合并調(diào)節(jié)終濃度為 50 μg ／ mL。取昆明種小鼠 360 只，隨機(jī)分為對照組和試驗組，每組180 只。對照組為生理鹽水，試驗組經(jīng)腹腔注射 LPS 多價抗原，0.5 mL ／ 只。免疫7 d 后分別用同種屬其他菌株（18 株）進(jìn)行攻擊，攻菌劑量為2 LD50，觀察5 ～7 d，記錄小鼠死亡數(shù)，并計算多價抗原對其他菌株的保護(hù)性，應(yīng)不低于50%。

1.11 數(shù)據(jù)分析 采用 Excel 2007 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 抗生素耐藥性 大多數(shù)PM 對7 種抗生素具有耐藥性，尤其對四環(huán)素和氯霉素耐藥性較高，分別為83.87%和87.09%，對替卡西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥性分別為58.06%、51.61%和45.16%，但對亞胺培南、頭孢噻肟敏感，耐藥性僅為3.23%和29.03%。PM 具有多重耐藥性，選擇至少耐受4 種抗生素的菌株，共 13 株：PM13、PM15、PM28、PM43、PM62、PM66、PM92、PM100、PM104、PM105、PM107、PM109、PM110，見表 1。

表1 PM 候選菌株抗生素耐藥性篩選結(jié)果Tab.1 Screening of candidate PM strains by antibiotic resistance

2.2 菌株毒力 13 株P(guān)M 毒力大小順序為：PM15 ＞PM28 ＞ PM92 ＞ PM43 ＞ PM62 ＞ PM13 ＞ PM109 ＞PM100 ＞ PM104 ＞ PM107 ＞ PM105 ＞ PM110 ＞ PM66，見表2。選擇9 株毒力較強(qiáng)的菌株，分別為：PM13、PM15、PM28、PM43、PM62、PM92、PM100、PM104、PM109。

表2 PM 候選菌株LD50 檢測結(jié)果Tab.2 Determination of LD50 of candidate PM strains

2.3 在位消化不同時間對LPS 抗原含量的影響 在620 nm 波長下，經(jīng)蒽酮-硫酸法測定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y = 0.007 9 x + 0.049 9，R2= 0.995 7。LPS抗原隨消化時間延長，含量逐漸增加，在66 ～72 h基本達(dá)到穩(wěn)定，見表3。

表3 在位消化不同時間的LPS 抗原含量Tab.3 LPS antigen contents after in-situ digestion for various hours

2.4 LPS 的抗原活性

2.4.1 免疫原性 9 株P(guān)M 的ED50有一定差異：PM100 ＞ PM104 ＞ PM15 ＞ PM92 ＞ PM43 ＞ PM13 ＞PM62 ＞ PM28、PM109，均符合試驗要求，見表 4。

表4 9 株P(guān)M LPS 抗原的ED50Tab.4 ED50 for LPS antigen of nine PM strains

2.4.2 安全性 不同候選菌株LPS 抗原注射后，開始2 d 豚鼠體重有所減輕，但不明顯，1 周后體重恢復(fù)至觀察期且均呈增長趨勢，且注射部位無結(jié)塊、壞死等現(xiàn)象發(fā)生，因此，9 株菌均符合要求。

2.4.3 毒性 不同菌株LPS 抗原的毒性有一定差異：PM15 ＞ PM100 ＞ PM13 ＞ PM43 ＞ PM62 ＞ PM109 ＞PM92 ＞ PM28 ＞ PM104，其中 PM15、PM100、PM109 毒性較大，LD50分別為 0.379、0.594 和 0.424 mg ／ mL，PM104 毒性最小，為max，見表5。根據(jù)LD50不低于0.6 mg ／mL 的要求，應(yīng)選擇菌株 PM13、PM28、PM43、PM62、PM92 和 PM104。

表5 不同PM LPS 抗原的LD50Tab.5 LD50 of LPS antigen of various PM strains

2.5 同一性試驗 Dienes 試驗結(jié)果顯示，PM13、PM28、PM43、PM62、PM92、PM104 均不屬于同一株菌株，部分試驗結(jié)果見圖1。

圖1 PM Dienes 試驗結(jié)果Fig.1 Dienes test result of PM

2.6 LPS 多價抗原的保護(hù)性

2.6.1 侯選菌株保護(hù)性 LPS 多價抗原對6 株侯選菌株的保護(hù)率均在70%以上，均符合要求，見表6。

表6 LPS 多價抗原對候選菌株的保護(hù)性Tab.6 Protective effect of polyvalent LPS antigen on candidate strains

2.6.2 其他菌株的保護(hù)性 LPS 多價抗原對18 株P(guān)M 的保護(hù)率在20% ～90%之間，具有一定差異，其中保護(hù)率 ≥ 50%的占77.78%，表明PM LPS 多價抗原能廣泛性預(yù)防PM 其他菌株的感染。見表7。

表7 LPS 多價抗原對同種屬其他菌株的交叉保護(hù)性Tab.7 Cross-protective effect of polyvalent LPS antigen on the other PM strains

3 討 論

為了減少臨床抗生素使用及術(shù)后感染風(fēng)險，為預(yù)防用疫苗的制備生產(chǎn)提供生產(chǎn)用菌株，本研究通過抗生素耐藥性和菌株毒力試驗從31 株P(guān)M 中篩選出9 株候選菌株，又通過對9 株菌株LPS 抗原的免疫原性、毒性及安全性試驗，獲得6 株免疫原性高、毒性小且安全性強(qiáng)的候選菌株，分別為PM13、PM28、PM43、PM62、PM92、PM104。耐藥性試驗結(jié)果表明，PM 均具有多重耐藥性，尤其對四環(huán)素和氯霉素耐藥性較高，分別為96.30%和88.89%，但對亞胺培南、頭孢噻肟較為敏感，耐藥性僅為3.23%和29.03%，這與文獻(xiàn)報道基本一致［9］。因此，醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)對抗生素使用的管理及使用，除此之外，可尋求其他有效的預(yù)防途徑。

近些年來，全菌體疫苗、減毒疫苗［10］及DNA 疫苗［11］相繼得到研究，但由于全菌體疫苗除保護(hù)性抗原外，還有許多與免疫保護(hù)不相關(guān)或有毒的成分，毒副反應(yīng)大，在人體內(nèi)的使用受限，DNA 疫苗在體內(nèi)隨機(jī)重組，存在安全性問題。因此，與免疫有關(guān)的各種組分疫苗愈來愈受到研究者的關(guān)注。PM 的致病性主要來源于病毒溶血素（hemolysins，HpmA）［12］、鞭毛（flagella）［13］、菌毛（fimbriae）［14］、外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）［15］及 LPS［16-17］等。LPS 作為構(gòu)成革蘭陰性細(xì)菌的外層細(xì)胞膜，是其最可變的成分。LPS 被認(rèn)為在尿路感染過程中起重要作用，影響膀胱和腎結(jié)石的形成［6，18］。LPS 的制備方法包括熱酚水法［19］和冷酚水法［20］、酚 ／ 氯仿抽提法等。由于苯酚和氯仿存在毒副作用，本研究采用鹽酸羥胺萃取法提取PM LPS 抗原，通過優(yōu)化在位消化反應(yīng)，獲得最佳萃取時間為72 h，經(jīng)檢測，LPS 含量達(dá)1.15 mg ／ mL。

本研究選擇6 株P(guān)M 制備LPS 多價抗原，分別對候選株和同種屬其他菌株進(jìn)行交叉免疫保護(hù)性檢測，評價各菌株是否適合用于生產(chǎn)研究。試驗結(jié)果表明，該LPS 多價抗原對候選株具有完全的保護(hù)作用（≥70%以上），對同種屬其他菌株攻擊的交叉保護(hù)作用在20% ～90%之間（保護(hù)性 ≥ 50%的占77.78%），其中對部分菌株的保護(hù)效果較低，可能是由于其與候選株之間不是同一亞型或親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在后續(xù)試驗中可重點考察對這幾株P(guān)M 的保護(hù)性，以期達(dá)到對同種屬其他菌株的預(yù)期保護(hù)效果。本研究旨在制備初步選擇的6 株P(guān)M LPS 多價抗原，可作為預(yù)防用疫苗，對醫(yī)院條件致病菌感染的治療及預(yù)防流行病研究具有重要意義。由于LPS 具有較強(qiáng)的毒副作用，后續(xù)仍需繼續(xù)開展類脂A 去除及工藝放大研究，為實現(xiàn)PM LPS 抗原企業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。