個(gè)體化細(xì)胞及核酸治療性腫瘤疫苗臨床藥效學(xué)研究概況

賀慶，張橫 綜述，王軍志 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院創(chuàng)新疫苗及生物技術(shù)產(chǎn)品評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629

腫瘤是一種多基因參與、多步驟發(fā)展的全身性、系統(tǒng)性疾病，基因組穩(wěn)定性喪失是腫瘤細(xì)胞基本特征之一，其異常生物學(xué)行為主要表現(xiàn)為無(wú)限復(fù)制、血管生成、侵襲與轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等。目前，腫瘤所致人口死亡數(shù)約占我國(guó)人口死亡總數(shù)的23%，且發(fā)病率不斷上升，已成為威脅人類生命健康的首要疾?。?-2］。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入及腫瘤放化療顯現(xiàn)出的諸多缺陷，目前免疫治療（包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑、過繼細(xì)胞治療、細(xì)胞因子和腫瘤疫苗）已成為治療腫瘤的趨勢(shì)和主流［3-4］，特別是腫瘤疫苗對(duì)防治腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)，已逐漸引起人們的關(guān)注?；颊吣[瘤異質(zhì)性和人白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）異質(zhì)性是影響腫瘤疫苗藥效作用的關(guān)鍵因素［5-6］。細(xì)胞疫苗含有腫瘤細(xì)胞的所有抗原，設(shè)計(jì)和生產(chǎn)疫苗前無(wú)需對(duì)這些抗原進(jìn)行系統(tǒng)而繁瑣的鑒定，制備時(shí)間較短；核酸疫苗設(shè)計(jì)靈活，可同時(shí)編碼腫瘤抗原和免疫調(diào)節(jié)分子，易于量產(chǎn)。針對(duì)這兩類疫苗的特點(diǎn)，開發(fā)個(gè)體化治療性腫瘤疫苗已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和未來(lái)方向［7-9］，對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的科學(xué)監(jiān)管也應(yīng)引起重視。本文對(duì)2002 — 2020年期間個(gè)體化細(xì)胞與核酸治療性腫瘤疫苗的Ⅰ～Ⅲ期臨床藥效學(xué)研究概況作一綜述，以期為該類疫苗的相關(guān)研發(fā)和評(píng)價(jià)監(jiān)管提供參考。

1個(gè)體化細(xì)胞治療性腫瘤疫苗的臨床藥效學(xué)研究

目前，處于臨床研究階段的個(gè)體化細(xì)胞治療性腫瘤疫苗主要包括個(gè)體化樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）治療性腫瘤疫苗和個(gè)體化腫瘤細(xì)胞治療性腫瘤疫苗，大多數(shù)處于Ⅰ期 ／ 初期（14 項(xiàng)，治療包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、B 細(xì)胞淋巴瘤、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病和胰腺癌）和Ⅱ期（4 項(xiàng)，治療包括黑色素瘤、卵巢癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）臨床研究階段，少數(shù)處于Ⅲ期（1 項(xiàng)，治療包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）臨床研究階段。

個(gè)體化DC 治療性腫瘤疫苗發(fā)展初期的設(shè)計(jì)思路一般是利用患者自體腫瘤制備腫瘤裂解物（autologous tumor lysate，ATL）融合性 DC，隨著基因深度測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)展，可利用上述技術(shù)分析患者自體腫瘤的新抗原，制備腫瘤新抗原肽融合性DC；個(gè)體化腫瘤細(xì)胞治療性腫瘤疫苗的整體設(shè)計(jì)思路一般是利用患者ATL 作為免疫原。上述疫苗聯(lián)合佐劑可經(jīng)皮下或淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫患者，其臨床藥效學(xué)研究一般側(cè)重評(píng)價(jià)疫苗的特異性細(xì)胞免疫原性。

1.1個(gè)體化DC 治療性腫瘤疫苗的臨床藥效學(xué)研究

1.1.1 ATL 融合性DC 與鑰孔戚血藍(lán)素（keyhole limpethemocyanin，KLH）融合性 DC 的混合疫苗 2002年，CHANG 等［10］對(duì)該混合疫苗治療晚期癌癥（14 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究。疫苗經(jīng)皮內(nèi)注射免疫晚期癌癥患者，免疫前后患者的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）與 ATL 或 KLH 共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法、流式細(xì)胞術(shù)-MHC ／ 肽四聚物+T 細(xì)胞法檢測(cè)抗原特異性T 細(xì)胞，評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫原性；將ATL 或KLH 刺激后的PBMCs 與氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine）共同孵育，對(duì)［3H］標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)T 細(xì)胞增殖情況；免疫前后經(jīng)患者皮內(nèi)注射ATL 抗原或KLH，檢測(cè)皮膚硬化情況，評(píng)價(jià)延遲型超敏反應(yīng)（delayed-type hypersensitivity，DTH）；光鏡和免疫組化法分析疫苗接種部位血管周圍淺表淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果顯示，該疫苗不會(huì)引起患者產(chǎn)生Ⅲ或Ⅳ級(jí)毒副反應(yīng)及自身免疫疾??；疫苗接種部位出現(xiàn)CD4+和CD8+T 細(xì)胞的局部積累；可誘導(dǎo)患者PBMCs 產(chǎn)生針對(duì)KLH 的增殖反應(yīng)；可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生針對(duì)自體腫瘤（3 ／ 7）和 KLH（5 ／ 6）的細(xì)胞免疫反應(yīng)及針對(duì)自體腫瘤（4 ／10）和KLH（8 ／9）的DTH；2 例黑色素瘤患者分別出現(xiàn)了部分和輕微的臨床反應(yīng)。

1.1.2 自體腫瘤肽融合性DC 疫苗 2005年，LIAU等［11］對(duì)一種自體腫瘤肽融合性DC 疫苗治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（12 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究。疫苗經(jīng)皮內(nèi)注射免疫膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，將免疫前后患者的外周血T 細(xì)胞與自體腫瘤細(xì)胞共同孵育，采用Alamar藍(lán)細(xì)胞毒 T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）試驗(yàn)評(píng)價(jià)T 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示，該疫苗未引起患者產(chǎn)生毒性或嚴(yán)重不良反應(yīng)；1 例患者產(chǎn)生客觀臨床反應(yīng)，6 例患者檢測(cè)到抗腫瘤CTL 反應(yīng)；免疫后再次手術(shù)的8 例患者中，4 例產(chǎn)生腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)性CTL 增加，T 細(xì)胞浸潤(rùn)大小與腫瘤內(nèi)TGF-h2 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與臨床生存期呈正相關(guān)；受試患者的腫瘤進(jìn)展時(shí)間（time to tumor progression，TTP）和總生存期（overall survival，OS）顯著長(zhǎng)于對(duì)照組。

1.1.3 ATL 融合性 DC 疫苗

1.1.3.1 單獨(dú)使用ATL 融合性DC 疫苗 2011年，F(xiàn)ADUL 等［12］對(duì) ATL 融合性 DC 疫苗治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（10 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究。ATL經(jīng)皮內(nèi)注射免疫患者，測(cè)量注射部位皮膚紅斑和硬結(jié)大小，評(píng)價(jià)患者DTH。疫苗經(jīng)頸淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫患者，將免疫前后患者的淋巴細(xì)胞與疫苗共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫原性；染料稀釋增殖試驗(yàn)（dye dilution proliferation assay，DDPA）評(píng)價(jià)T 細(xì)胞增殖和免疫反應(yīng)；流式細(xì)胞術(shù)分析疫苗和外周血T 細(xì)胞表型特征；Kaplan-Meier 曲線分析患者無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和 OS。結(jié)果顯示，疫苗不會(huì)引起患者產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)；可顯著增加患者腫瘤特異性CD4+T 細(xì)胞；患者6個(gè)月PFS 為 90%，中位 PFS 為 9.5 月，OS 為 28 月；患者腫瘤特異性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生與生存期的延長(zhǎng)具有相關(guān)性。

1.1.3.2 ATL 融合性DC 疫苗聯(lián)合 IL-2 2006年，WEI 等［13］對(duì) ATL 融合性 DC 疫苗 Dendritomas 聯(lián)合低劑量IL-2 治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤（10 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究。Dendritomas 聯(lián)合低劑量IL-2 經(jīng)皮下注射免疫轉(zhuǎn)移性黑色瘤患者，將免疫前后患者的血液與 ATL 共同孵育，流式細(xì)胞術(shù)-IFNγ+、CD4+／ CD8+、CD69+T 細(xì)胞法檢測(cè)抗原肽的細(xì)胞免疫原性。結(jié)果顯示，患者（8 ／9）可對(duì)疫苗產(chǎn)生T 細(xì)胞反應(yīng)；1 例患者產(chǎn)生完全反應(yīng)，2 例患者病情穩(wěn)定（分別為9 和4個(gè)月）；疫苗產(chǎn)生的不良反應(yīng)小于Ⅱ級(jí)，具有較好耐受性。

2007年，WEI 等［14］對(duì) Dendritomas 聯(lián)合低劑量IL-2 治療Ⅳ期腎細(xì)胞癌（10 例）進(jìn)行了一項(xiàng)初步臨床研究。Dendritomas 聯(lián)合低劑量IL-2 經(jīng)皮下注射免疫Ⅳ期腎細(xì)胞癌患者，將患者血液或PBMCs 與ATL共同孵育，流式細(xì)胞術(shù)-IFNγ+、CD4+／ CD8+、CD69+T細(xì)胞法或ELISA-IFNγ 法檢測(cè)抗原肽的細(xì)胞免疫原性。結(jié)果顯示，免疫后患者的CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)率為100%（9 ／ 9），CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)率為 62.5%（5 ／ 8）；患者的臨床反應(yīng)率為40%；疫苗具有較好耐受性。

2016年，GREENE 等［15］對(duì) Dendritoma 聯(lián)合低劑量IL-2 治療黑色素瘤（25 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ ／ Ⅱa期研究。Dendritomas 聯(lián)合低劑量IL-2 經(jīng)皮下注射免疫黑色素瘤患者，結(jié)果顯示，所有受試患者的中位OS 為16.1 月，預(yù)計(jì)5年生存率為29%；疫苗接種次數(shù) ≥ 3 次的受試患者中位OS（21.5 月）顯著長(zhǎng)于接種次數(shù)＜3 次的受試患者（8.3 月），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.02）；參與Ⅰ期（10 例）與Ⅱa 期（15 例）研究的受試患者無(wú)臨床病理差異，Ⅱa 期受試患者疫苗接種次數(shù)多于Ⅰ期受試患者，Ⅱa 期受試患者的中位 OS（23.8 月）顯著長(zhǎng)于Ⅰ期受試患者（8.7 月），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.004）；疫苗聯(lián)合IL-2 療法的毒性小于Ⅲ級(jí)。

1.1.3.3 ATL 融合性 DC 疫苗（DCVax-L）聯(lián)合其他療法 2013年，KANDALFT 等［16］對(duì) DCVax-L 聯(lián)合抗血管生成療法或再過繼移植體外活化的T 細(xì)胞治療復(fù)發(fā)性卵巢癌（6 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究。疫苗經(jīng)皮內(nèi)注射免疫復(fù)發(fā)性卵巢癌患者，將免疫前后患者的PBMCs 與疫苗共同孵育，或?qū)U(kuò)增并經(jīng)預(yù)刺激的CD8+T 細(xì)胞分別與轉(zhuǎn)染HLA-A2 的SKOV3 細(xì)胞、HER2 ／neu 369 或 689 肽融合性 T2 細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞裂解物融合自體DCs 共同孵育，ELISPOT-IFNγ法評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫原性；免疫組化法分析腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)性CD3+T 細(xì)胞和MHCⅠ表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)分析患者外周CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）水平；蛋白芯片法檢測(cè)患者血清IgG 和IgM 含量。結(jié)果顯示，疫苗免疫組（6 例）具有較好耐受性，不會(huì)產(chǎn)生大于Ⅱ級(jí)的毒副反應(yīng)；疫苗聯(lián)合抗血管生成療法可引起4 名患者（6 例）產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)和臨床效益；過繼移植體外活化的T 細(xì)胞可降低2 名患者（3 例）外周Tregs 細(xì)胞水平；疫苗可引起患者（2 例）血清IgG 和IgM 陽(yáng)轉(zhuǎn)率升高。

2018年，LIAU 等［17］對(duì) DCVax-L 治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（331 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅲ期研究。疫苗經(jīng)皮內(nèi)注射免疫膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，結(jié)果顯示，受試患者（331例）的術(shù)后中位OS 為23.1 月，3年生存率為25.4%；甲基化O6 甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶型（O6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT）受試患者（131 例）的術(shù)后中位 OS 為 34.7 月，3年生存率為46.4%；僅2.1%受試患者（7 例）出現(xiàn)Ⅲ或Ⅳ級(jí)不良反應(yīng)，其總體不良反應(yīng)與單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)療法相當(dāng)，疫苗具有較好耐受性；該疫苗聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)療法治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是可行和安全的，并可延長(zhǎng)生存期。

1.1.3.4 ATL 融合性DC 疫苗與膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原（glioma-associated antigen，GAA）融合性 DC 疫苗的比較 2013年，PRINS 等［18］對(duì) ATL 融合性 DC 疫苗（28 例）和膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原（glioma-associated antigen，GAA）融合性DC 疫苗（6 例）治療惡性膠質(zhì)瘤各進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究。疫苗經(jīng)皮內(nèi)注射免疫惡性膠質(zhì)瘤患者，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血中免疫細(xì)胞（如CD3+CD4+輔助性 T 細(xì)胞、CD3+CD8+CTL、CD3-CD16+NK、CD3+CD16+自然殺傷 T 細(xì)胞、CD3-CD19+B 細(xì)胞、CD3+CD4+CD25+CD127lowTreg 增殖情況。結(jié)果顯示，ATL 融合性DC 疫苗引發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)具有更好的特異性和多樣性；兩種疫苗接種后／ 接種前Treg比率的降低與患者生存時(shí)間的延長(zhǎng)具有顯著相關(guān)性；兩種疫苗的不良反應(yīng)率和嚴(yán)重程度相似，主要為Ⅰ～Ⅱ級(jí)不良反應(yīng)。

1.1.4 自體腫瘤融合性 DC 疫苗 2009年，DI NICOLA 等［19］對(duì)自體腫瘤融合性 DC 疫苗治療 B 細(xì)胞淋巴瘤患者（18 例）進(jìn)行了一項(xiàng)初步臨床研究。疫苗經(jīng)皮下注射免疫B 細(xì)胞淋巴瘤患者，將免疫前后患者的外周血來(lái)源淋巴細(xì)胞與抗原肽共同孵育，或?qū)⒘馨徒Y(jié)來(lái)源T 細(xì)胞與自體B 腫瘤細(xì)胞共同孵育，ELISPOT-IFNγ ／ IL-4 法評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫原性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血和淋巴結(jié)中CD4+CD25+FOXP3+T 細(xì)胞（Tregs）、外周血 CD56dimCD16+CD3-細(xì)胞［自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK）］和腫瘤部位CCR7+CD45RA+CD3+CD8+細(xì)胞（成熟T 細(xì)胞）的增殖情況，評(píng)價(jià)疫苗的反應(yīng)效應(yīng)。HLA 穩(wěn)定試驗(yàn)分析肽段與HLA-A2 的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，該疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)受試患者產(chǎn)生T 細(xì)胞和B 細(xì)胞應(yīng)答；18 例受試患者中6 例產(chǎn)生客觀臨床反應(yīng)（3 例產(chǎn)生持續(xù)完全反應(yīng)，3 例產(chǎn)生部分反應(yīng)），中位隨訪時(shí)間為50.5 月；8 例患者病情穩(wěn)定，4 例病情有進(jìn)展。

1.1.5個(gè)體化全腫瘤細(xì)胞裂解物融合性DC 疫苗2012年，CHO 等［20］對(duì)一種個(gè)體化全腫瘤細(xì)胞裂解物融合性DC 疫苗治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（34 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅱ期研究。疫苗經(jīng)皮下注射免疫多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，以O(shè)S、存活率、PFS、生活質(zhì)量和不良反應(yīng)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示，疫苗組（18 例）的1、2 和3年存活率分別為88.9%、44.4%和16.7%，對(duì)照組（16 例）分別為75.0%、18.8%和0%（P 分別為 0.299 0、0.003 5、0.001 4）；疫苗組和對(duì)照組的中位 OS 分別為 31.9 和 15.0 月（P ＜ 0.002），中位 PFS分別為 8.5 和 8.0 月（P = 0.075）；Kaplan-Meier 分析顯示，疫苗組的存活率顯著高于對(duì)照組。

1.1.6 次氯酸氧化型ATL 融合性DC（HOCl-oxidized autologous whole tumorlysate-pulsed DCs，OCDC）疫苗2013年，CHIANG 等［21］對(duì)一種 OCDC 的個(gè)體化疫苗治療卵巢癌（5 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究。疫苗經(jīng)淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫卵巢癌患者，將免疫前后患者的PBMCs 與疫苗共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法、流式細(xì)胞術(shù)-HER-2／neu 四聚物+CD8+T 細(xì)胞法檢測(cè)培養(yǎng)液中Th1（IFNγ）、Th2 細(xì)胞因子（IL-10、IL4、IL-5）和 IL-17的濃度，評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫原性；同時(shí)檢測(cè)免疫前后患者 PBMCs 中 IFNγ+CD3+／ Treg 細(xì)胞比率和血清IL-10 濃度，評(píng)價(jià)患者的免疫狀態(tài)。結(jié)果顯示，疫苗具有較好耐受性；可有效誘導(dǎo)患者產(chǎn)生T 細(xì)胞反應(yīng)，并引起患者外周Treg 細(xì)胞和血清IL-10 降低；2 例患者接種疫苗后產(chǎn)生＞24 月的PFS。

1.1.7個(gè)體化肽融合性DC 疫苗 2017年，SHEN等［22］根據(jù)肝癌的腫瘤突變和表達(dá)范圍建立候選抗原肽文庫(kù)，參考免疫前患者針對(duì)這些候選肽的細(xì)胞免疫原性選擇相應(yīng)的候選抗原肽作為免疫原，將這些個(gè)體化肽融合DC 制備成疫苗。疫苗經(jīng)皮下注射免疫患者，并將該疫苗體外活化的CTL 過繼輸入患者體內(nèi)，對(duì)該個(gè)體化疫苗（PPV-DC-CTL）聯(lián)合放射療法治療晚期肝癌（9 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究，結(jié)果顯示，該療法不會(huì)引起患者產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，具有較好耐受性，且可較好控制患者疾?。ǚ磻?yīng)率為33%，疾病控制率為 66%，9 例）。

1.1.8 腫瘤新抗原肽融合性DC 疫苗 2018年，TANYI 等［23］采用全外顯子測(cè)序和HLAⅠ-肽預(yù)測(cè)性結(jié)合算法（如NetMHC-3.4）分析腫瘤的突變肽（腫瘤新抗原肽），對(duì)一種OCDC 制備的個(gè)體化疫苗治療卵巢瘤（25 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究。該疫苗經(jīng)淋巴結(jié)注射卵巢癌患者，以免疫前和免疫中患者PBMCs來(lái)源的CD4 和CD8 T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，OCDC 及自體腫瘤細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，ELISPOT-IFNγ 法，流式細(xì)胞術(shù)-IL-2±、TNF-α±、IFNγ±、突變肽-MHC 多聚物±、CD4±／ CD8±T 細(xì)胞法評(píng)價(jià)自體腫瘤細(xì)胞和突變肽的細(xì)胞免疫原性，51Cr 釋放試驗(yàn)評(píng)價(jià)治療中效應(yīng)細(xì)胞（CD3 ／ CD28-擴(kuò)增型 PBMCs）對(duì)靶細(xì)胞（自體腫瘤細(xì)胞）的殺傷效果，NSG 小鼠建立患者自體腫瘤移植瘤模型評(píng)價(jià)治療中效應(yīng)細(xì)胞（CD3 ／ CD28-擴(kuò)增型PBMCs）對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示，該疫苗可誘導(dǎo)患者產(chǎn)生針對(duì)自體腫瘤抗原的T 細(xì)胞反應(yīng)，該反應(yīng)與顯著延長(zhǎng)患者的生存期具有相關(guān)性；疫苗也可增強(qiáng)患者產(chǎn)生針對(duì)腫瘤非同義體細(xì)胞突變肽的T細(xì)胞反應(yīng)（包括免疫后新誘導(dǎo)產(chǎn)生的新表位特異性T細(xì)胞反應(yīng)，以及免疫前預(yù)先存在的新表位T 細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)新表位具有更高親合力的T 細(xì)胞克?。灰呙绻裁庖?92 劑均未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)；疫苗治療中產(chǎn)生的T 細(xì)胞對(duì)NSG 小鼠體內(nèi)移植瘤的抑制作用顯著強(qiáng)于治療前的T 細(xì)胞。

2019年，SARIVALASIS 等［24］采用測(cè)序、質(zhì)譜和HLA-肽預(yù)測(cè)性結(jié)合算法分析腫瘤的突變肽（腫瘤新抗原肽），對(duì) ATL 融合性 DC 疫苗（OCDC）及 OCDC聯(lián)合腫瘤新抗原肽融合性DC 疫苗（PEP-DC）治療晚期高度漿液性卵巢癌（16 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ ／ Ⅱ期研究。疫苗經(jīng)淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫卵巢癌患者，用免疫前后患者PBMCs 和腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TILs）制備的 CD4±和 CD8±T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，ELISPOT-IFNγ 法評(píng)價(jià)抗原肽的細(xì)胞免疫原性。結(jié)果顯示，依次采用OCDC、PEP-DC治療患者的方法可產(chǎn)生較好的效果，能促進(jìn)患者產(chǎn)生多種抗原特異性的免疫反應(yīng)，擴(kuò)增已存在的新抗原特異性T 細(xì)胞克隆。

2019年，BASSANI-STERNBERG 等［25］采用外顯子組測(cè)序、質(zhì)譜、HLA-Ⅰ和Ⅱ-肽預(yù)測(cè)性結(jié)合算法（如MixMHCpred.v2.0.2、MixMHC2pred.v1）分析腫瘤的HLA-Ⅰ和Ⅱ-結(jié)合肽，對(duì)PEP-DC 聯(lián)合藥物（吉西他濱 ／ 卡培他濱、阿司匹林、納武單抗）治療切除型胰腺癌患者（3 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰb 期研究。疫苗經(jīng)皮下注射免疫切除型胰腺癌患者，將免疫前后患者的PBMCs 與抗原肽共同孵育，流式細(xì)胞術(shù)-ICS（CD3、CD8、CD4、IL-2、TNF-α 和 IFNγ）法檢測(cè)抗原肽的細(xì)胞免疫原性。結(jié)果顯示，患者中抗原特異性CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生率為 100%（3 ／ 3）。

1.1.9 ATL 顆粒負(fù)荷性DC 疫苗（autologous tumor lysate，particle-loaded，dendritic cell，TLPLDC） 2018年，HERBERT 等［26］對(duì) TLPLDC 治療實(shí)體瘤（44 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ ／ Ⅱa 期臨床研究。結(jié)果顯示，TLPLDC具有較好安全性，主要表現(xiàn)為Ⅱ級(jí)以下毒性反應(yīng)，最常見為流感樣癥狀；39%（12 ／ 31）患者可產(chǎn)生臨床獲益（2 例完全反應(yīng)、4 例部分反應(yīng)和6 例疾病穩(wěn)定）。

1.1.10 腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）mRNA 轉(zhuǎn)染性 DC 疫苗 2020年，WANG 等［27］對(duì)一種轉(zhuǎn)染TAA mRNA 的個(gè)體化DC 疫苗聯(lián)合低劑量環(huán)磷酰胺、poly I：C、咪喹莫特和anti-PD-1 抗體治療實(shí)體瘤（多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和腦轉(zhuǎn)移型非小細(xì)胞肺癌，各5 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究。疫苗同時(shí)經(jīng)皮下和靜脈注射免疫實(shí)體瘤患者，用免疫前后患者PBMCs及其制備的非黏附型T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，自體TAA融合性成熟DC 作為抗原提呈細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)-CD3+、CD4+／ CD8+、IFNγ+、TNF-α+細(xì)胞法檢測(cè) TAA 特異性T 細(xì)胞（細(xì)胞免疫原性）。結(jié)果顯示，在接受細(xì)胞免疫原性反應(yīng)測(cè)試的7 名患者中，大多數(shù)TAA 可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，其與TAA 在腫瘤組織中的表達(dá)水平無(wú)關(guān)，這些患者均未發(fā)生明顯自身免疫性不良反應(yīng)，T 細(xì)胞反應(yīng)與患者產(chǎn)生較好的總體生存率相關(guān)。

1.2個(gè)體化腫瘤細(xì)胞治療性腫瘤疫苗的臨床藥效學(xué)研究

1.2.1 自體慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）腫瘤細(xì)胞疫苗（CLL ／GM-K562） 2013年，BURKHARDT 等［28］對(duì) CLL ／ GM-K562 治療同種異體造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）后早期的 CLL 患者（18 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究。疫苗經(jīng)皮下和皮內(nèi)注射免疫CLL 患者，將免疫前后患者PBMCs 與自體腫瘤細(xì)胞共同孵育，ELISPOT-IFNγ 法檢測(cè)CLL 特異性CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，Luminex 法檢測(cè)培養(yǎng)液中GM-CSF、TNF-α、IL-2 和 IL-10，評(píng)價(jià) CD8+T 細(xì)胞功能。結(jié)果顯示，接種疫苗患者的2年P(guān)FS 和OS 分別為82%和88%；免疫后患者的17%CD8+T 細(xì)胞克隆可對(duì)CLL 相關(guān)抗原產(chǎn)生反應(yīng)。

1.2.2 自體腫瘤細(xì)胞疫苗（Gliovac） 2015年，SCHIJNS等［29］對(duì)聯(lián)合同種異體和自體神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞裂解物的腫瘤細(xì)胞疫苗（Gliovac）治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）（9 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究。疫苗經(jīng)皮內(nèi)注射免疫GBM 患者，結(jié)果顯示，9 例患者的26 周生存率為 100%（對(duì)照組為33%），40 周存活率為77%；該疫苗具有較低的毒性和較好的療效。

2個(gè)體化核酸治療性腫瘤疫苗的臨床藥效學(xué)研究

個(gè)體化核酸治療性腫瘤疫苗的整體設(shè)計(jì)思路一般為分析并采用編碼患者自體腫瘤突變肽／ 新抗原的核酸作為免疫原，將其聯(lián)合佐劑免疫患者。目前，僅有少量核酸疫苗處于Ⅰ或Ⅰ ／ Ⅱ期（2 項(xiàng)，治療包括黑色素瘤和胃腸癌）臨床研究階段，且為RNA 或mRNA 疫苗，其臨床藥效學(xué)研究也側(cè)重評(píng)價(jià)疫苗的特異性細(xì)胞免疫原性。

2.1個(gè)體化突變肽 RNA 疫苗 2017年，SAHIN 等［30］對(duì)一種編碼腫瘤患者個(gè)體化突變肽的RNA 疫苗治療黑色素瘤（13 例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ期研究。疫苗經(jīng)腹股溝淋巴結(jié)注射免疫黑色素瘤患者，以免疫前后患者血液中CD4+和CD8+T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染編碼突變肽RNA 的輻照滅活性自體CD4-或CD8-PBMCs 作為抗原提呈細(xì)胞，ELISPOT-IFNγ 法評(píng)價(jià)突變肽的細(xì)胞免疫原性。T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，負(fù)荷新表位RNA 的自體DCs 作為抗原提呈細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分選單個(gè)IFNγ+CD8+T 細(xì)胞，鑒定其T細(xì)胞受體（T cell receptors，TCR）克隆。同時(shí)，將轉(zhuǎn)染抗原特異性 TCR-α ／ β 鏈的健康人 CD8+T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，表達(dá)患者相應(yīng)HLA 等位基因和抗原表位肽的K562 細(xì)胞系作為抗原提呈細(xì)胞或靶細(xì)胞，ELISPOT-IFNγ 法驗(yàn)證 CD8±抗原-HLA 間作用的特異性，采用caspase 3 ／ 7 或熒光素酶反映靶細(xì)胞凋亡情況或毒性。結(jié)果顯示，該個(gè)體化突變肽RNA 疫苗可有效誘導(dǎo)患者產(chǎn)生抗原特異性多克隆抗腫瘤T 細(xì)胞免疫反應(yīng)；13 例黑色素瘤患者的125個(gè)新表位中，60%具有免疫原性，每個(gè)患者可至少針對(duì)3個(gè)突變新表位產(chǎn)生T 細(xì)胞免疫反應(yīng)；75個(gè)具有免疫原性的新表位中，32%在患者體內(nèi)預(yù)先存在免疫原性，68%在患者體內(nèi)無(wú)預(yù)先存在免疫原性；72個(gè)具有免疫原性的新表位中，57%僅產(chǎn)生CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)，17%僅產(chǎn)生CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，26%可同時(shí)產(chǎn)生CD4+和CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)。接種疫苗后，患者的腫瘤轉(zhuǎn)移顯著降低，約75%患者的PFS 為27 月。

2.2 腫瘤新抗原mRNA疫苗（mRNA-4650） 2020年，CAFRI 等［31］采用全外顯子測(cè)序（whole-exome sequencing，WES）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）和 HLA-Ⅰ ／ Ⅱ-肽預(yù)測(cè)性結(jié)合算法（如netMHCpan-3.0、netMHCpanⅡ-3.1）分析患者的腫瘤新抗原，對(duì)一種編碼新抗原的mRNA 疫苗（mRNA-4650）治療轉(zhuǎn)移性胃腸癌（4例）進(jìn)行了一項(xiàng)Ⅰ／ Ⅱ期臨床研究。疫苗經(jīng)肌肉注射免疫轉(zhuǎn)移性胃腸癌患者，以免疫前后患者PBMCs 分離的T 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，將其與轉(zhuǎn)染串聯(lián)微基因（tandem minigene，TMG）或負(fù)荷抗原肽的 DC 共同孵育，再用負(fù)荷單個(gè)抗原肽的DCs 對(duì)其進(jìn)行刺激，流式細(xì)胞術(shù)-4-1BB+法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別或ELISPOT-IFNγ 法檢測(cè)抗原肽的細(xì)胞免疫原性。分選4-1BB 上調(diào)且經(jīng)再刺激的COL6A3 反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞TCR 測(cè)序，將轉(zhuǎn)染TCR 的外周血淋巴細(xì)胞（peripheral blood lymphocytes，PBLs）與 COL6A3-變異或野生肽融合性DCs 共同孵育；轉(zhuǎn)染患者相應(yīng)HLAsⅠ型分子且負(fù)荷相應(yīng)抗原肽的COS-7 細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，將其與COL6A3 和OR10H1 特異性T 細(xì)胞共同孵育；流式細(xì)胞術(shù)-4-1BB+法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別。結(jié)果顯示，該疫苗具有較好安全性；疫苗抗原中15.7%具有免疫原性，78.8%不具有免疫原性，5.5%預(yù)存在免疫原性；所有患者產(chǎn)生的新抗原特異性T 細(xì)胞反應(yīng)中41%為CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，59%為CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)；分離并驗(yàn)證得到可靶向KRASG120變異體的TCR；4 例受試患者未產(chǎn)生客觀臨床反應(yīng)。

3 小 結(jié)

綜上所述，患者對(duì)個(gè)體化DCs 治療性腫瘤疫苗產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)率約為70%；個(gè)體化RNA 治療性腫瘤疫苗中約40%的新抗原具有免疫原性，其誘導(dǎo)的T 細(xì)胞反應(yīng)中約60%為CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)；疫苗整體不會(huì)引起患者產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)（一般為Ⅰ～Ⅱ級(jí)），耐受性較好。個(gè)體化DCs 治療性腫瘤疫苗（DCVax-L）已開展1 項(xiàng)Ⅲ期臨床研究，其聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)療法治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是可行和安全的，并可延長(zhǎng)患者生存期；個(gè)體化核酸治療性腫瘤疫苗的臨床研究正處于起步階段。

研發(fā)治療性腫瘤疫苗的關(guān)鍵是選定患者腫瘤特異性抗原，針對(duì)該個(gè)性化因素，精準(zhǔn)篩選患者腫瘤特異性抗原正日益受到重視，也是治療性腫瘤疫苗發(fā)展的未來(lái)趨勢(shì)［32-34］。另外，影響腫瘤疫苗藥效作用的共性因素（包括免疫佐劑、制劑類型和給藥方式等）也應(yīng)得到關(guān)注，個(gè)體化細(xì)胞治療性腫瘤疫苗一般要求患者處于相對(duì)正常的免疫狀態(tài)，需要患者提供數(shù)量較多的DCs 和腫瘤細(xì)胞［35-37］；個(gè)體化核酸治療性腫瘤疫苗應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注提高免疫細(xì)胞攝取核酸的效率及核酸的穩(wěn)定性［35，38-40］；只有綜合考慮這些因素的影響，才能進(jìn)一步提高治療性腫瘤疫苗的藥效。