呼吸道合胞病毒滴度間接免疫熒光檢測方法的建立及驗證

宋月爽，陳曉旭，潘東，盧井才，張立娜，劉禹壯，原秀娟，段盛博，袁若森，趙慧

1.長春百克生物科技股份公司，吉林 長春 130012；2.吉林大學生命科學院，吉林 長春 130012；3.中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室衛(wèi)生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 102629

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是全球范圍內引起5歲以下兒童急性下呼吸道感染（acute lower respiratory tract infection，ALRTI）最重要的病毒性病原［1］。目前，尚無用于預防RSV 感染的市售疫苗及有效的抗病毒藥物用于RSV 治療［2］，唯一可用于RSV 預防的人源化特異性抗體帕利珠單抗（Palivizumab）尚未引進國內臨床應用［3-4］。RSV 疫苗和RSV 單抗一直是研究的熱點，其中長半衰期的預防性RSV 單抗正處于臨床試驗階段［5］，2021年在Ⅲ期臨床試驗中已達到試驗的主要終點。

目前，已有約20 種RSV 候選疫苗處于臨床階段［6］，RSV 滴度是疫苗相關研究的基礎之一，RSV滴度定量檢測方法有空斑法、半數定量（TCID50）法、免疫熒光法及RT-PCR 法等。其中空斑法和TCID50法需經細胞培養(yǎng)RSV 后定量檢測病毒滴度，耗時均較長［7］，如空斑法是將病毒培養(yǎng) 5 ～ 9 d，產生裸視可見足夠大的蝕斑后，經固定染色進行病毒滴度判定［8-10］。有研究對空斑法進行改良，將板內細胞和病毒培養(yǎng)時間縮短為2 d，并參照間接ELISA 法，加入單抗后再結合HRP 標記的二抗，顯色后進行肉眼觀察，檢測過程僅需 3 d［11］。RT-PCR 法靈敏度高，特異性強［12］，檢測周期短，但用于RSV 滴度檢測，需預先提取樣品RNA，過程較繁瑣，且對操作者的技術要求較高。間接免疫熒光法是采用特異性抗體與樣品中相應抗原反應，用熒光標記的二抗與特異性抗體結合，熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，以檢測未知抗原，該方法靈敏度和特異性較高，與臨床癥狀相關性好［3］。本實驗旨在建立用于RSV 滴度檢測的間接免疫熒光法，并對方法進行驗證，以期用于RSV臨床快速檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒及細胞 RSV A2 株（VR-1540）、RSV Long株（VR-26）、RSV 18537 株（VR-1580）、狂犬病病毒、風疹病毒、流感病毒和HEp-2 細胞均由長春百克生物科技股份公司保存并提供。

1.2 主要試劑 DMEM-Ham′s F12 培養(yǎng)基購自中科邁晨（北京）科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Penicillin-Streptomycin Solution（100 ×）購自武漢普賽諾生命科技有限公司；Synagis（Palivizumab）購自美國Medimmune 公司；熒光標記羊抗人IgG 購自美國Southern Biotech 公司。

1.3 方法的建立 將待檢RSV 進行5 倍系列稀釋（5-1～ 5-11），加入 96 孔板，50 μL ／ 孔，每個稀釋度設2個復孔；將HEp-2 細胞用含胎牛血清的DMEMHam′s F12 培養(yǎng)基，于 37 ℃培養(yǎng)至單層，用 0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化后，調整細胞密度，采用病毒和細胞同時接種的方法將細胞加入 96 孔板［12］，50 μL ／孔；同時設陰性對照（僅加入培養(yǎng)液和細胞懸液）和陽性對照（原倍病毒液）。于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，PBS 洗滌1 次，加入-20 ℃預冷的 80%丙酮，50 μL ／孔，4 ℃固定30 min；PBS 洗滌1 次，加入Synagis（Palivizumab），50 μL ／ 孔，于 37 ℃孵育 1 h；PBS 洗滌 3 次，加入熒光標記羊抗人IgG，50 μL／孔，于37 ℃孵育1 h；PBS 洗滌 3 次，加入 80%甘油，50 μL ／ 孔，熒光顯微鏡下進行熒光灶（focus-forming unit，F(xiàn)FU）計數，并按下式計算病毒滴度［13］。

病毒滴度（FFU ／ mL）=（最高稀釋倍數孔FFU 平均值 ×樣品稀釋倍數 + 相鄰孔稀釋倍數較低的FFU 平均值）／ 2 ×稀釋倍數較低孔病毒稀釋倍數× 20

1.4 方法的優(yōu)化

1.4.1 細胞接種密度及血清濃度的確定 將培養(yǎng)HEp-2 細胞的培養(yǎng)液中的胎牛血清終濃度設為2.5%、5%、10%、20%，細胞接種密度分別為 3 × 104、4 × 104、5 × 104、6 × 104、7 × 104、8 × 104個 ／ 孔［11］，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及密度。

1.4.2 培養(yǎng)時間的確定 以1.4.1 項確定的胎牛血清濃度及細胞接種密度培養(yǎng)HEp-2 細胞，病毒接種后分別培養(yǎng) 20、24、26、30、38、48 h，一抗稀釋倍數為 1 ∶1 000，二抗稀釋倍數為 1 ∶400，其他檢測步驟同1.3 項。對檢測數據相近的時間點再進行5 次檢測。選擇熒光灶輪廓清晰且病毒滴度最高的時間為最佳培養(yǎng)時間。

1.4.3 抗體稀釋度的確定 以1.4.1 項確定的胎牛血清濃度及細胞接種密度培養(yǎng)HEp-2 細胞，病毒接種后培養(yǎng)24 h；加入一抗，用PBS 分別稀釋為1 ∶（1 000 ／3）、1 ∶1 000、1 ∶3 000、1 ∶9 000；孵育后加入二抗，用 PBS 分別稀釋為 1 ∶（400 ／3）、1 ∶400、1 ∶1 200；其他步驟同1.3 項。熒光顯微鏡下觀察熒光灶強度高，背景強度弱，輪廓清晰，病毒滴度最高的稀釋度為一抗和二抗的最佳稀釋度。

1.5 方法的驗證

1.5.1 特異性 取 RSV A2 株（VR-1540）、狂犬病病毒、流感病毒、風疹病毒，采用建立的方法進行檢測，熒光顯微鏡下觀察特異性熒光的強度，驗證方法特異性。

1.5.2 線性范圍 以RSV A2 株（VR-1540）作為已知滴度的標準品，其滴度平均值作為理論滴度［8.48×107FFU ／ mL，滴度對數值（lgFFU ／ mL）為 7.93］，用DMEM-Ham′s F12 培養(yǎng)基稀釋為 1.70 × 107，3.39 ×106，6.79 × 105，1.36 × 105，2.71 × 104，5.43 ×103FFU／mL 6個稀釋度，采用建立的方法進行檢測，每個濃度重復3 次，計算均值及RSD，以各理論滴度為橫坐標，檢測滴度均值為縱坐標建立線性回歸曲線，獲得回歸方程。

1.5.3 準確性 以RSV A2 株（VR-1540）作為已知滴度的標準品，其滴度平均值作為理論滴度（8.48 ×107FFU ／ mL，lgFFU ／ mL 為 7.93），用 DMEM-Ham′s F12 培養(yǎng)基稀釋為 8.48 × 107、3.39 × 106、2.71 ×104FFU ／mL；將 RSV Long 株（VR-26）用 DMEM-Ham′s F12 培養(yǎng)基分別稀釋 52、54、57倍作為高、中、低滴度未加標樣品；將RSV A2 株（VR-1540）按濃度由高至低依次等體積加入高、中、低滴度的RSV Long 株（VR-26）病毒液中，即為加標樣品。采用建立的方法檢測加標和未加標樣品的病毒滴度，并按下式計算回收率。

回收率（%）=（加標樣品檢測值- 未加標樣品檢測值）／加入標準品理論值× 100%

1.5.4 重復性 同一操作人員采用建立的方法于同一時間點檢測 RSV A2 株（VR-1540）、RSV Long 株（VR-26）、RSV 18537 株（VR-1580）的病毒滴度，每個樣品重復檢測3 次，計算RSD。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，時間優(yōu)化中數據相近的時間點再進行5 次檢測的結果取均值，并進行配對t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 最佳細胞接種密度及血清濃度 細胞密度為 6 × 104個 ／ 孔及該濃度以上時，培養(yǎng) 24 h 均可達致密單層，4個胎牛血清終濃度下細胞生長形態(tài)一致。因此，選擇最低加入量2.5%為最佳胎牛血清濃度，6 × 104個 ／ 孔為最佳細胞接種密度。見圖1（僅顯示細胞密度為6 × 104個 ／ 孔于4個胎牛血清濃度培養(yǎng)基條件下的結果）。

圖1 HEp-2 細胞在含不同濃度胎牛血清培養(yǎng)液中的細胞形態(tài)（× 40）Fig.1 Cell morphology of HEp-2 in media containing various concentrations of FBS（× 40）

2.1.2 最佳培養(yǎng)時間 培養(yǎng)30、38、48 h 時細胞發(fā)生不同程度融合，無法清晰計數；培養(yǎng)20、24、26 h 時細胞可清晰計數，病毒滴度分別為2.67×107、6.64 ×107、8.54 × 107FFU ／ mL，見圖 2。培養(yǎng) 20 h 的滴度低于 24 和26 h，培養(yǎng) 24 和26 h 的結果較接近，分別再進行5 次檢測，檢測結果差異無統(tǒng)計學意義（t = 1.096，P = 0.334 6）。因此，確定最佳培養(yǎng)時間為 24 ～ 26 h。

圖2 病毒培養(yǎng)不同時間產生的特異性熒光（× 100）Fig.2 Specific fluorescent foci formed by virus cultured for various hours（× 100）

2.1.3 最佳抗體稀釋度 一抗稀釋度為1 ∶1 000和 1 ∶3 000，二抗稀釋度為 1 ∶（400 ／ 3）和 1 ∶400時，背景暗、熒光強度高，易于觀察計數。一抗稀釋度為1 ∶1 000，二抗稀釋度為1 ∶400 時病毒滴度最高，見表1。因此，確定該稀釋度為最佳抗體稀釋度。

表1 不同抗體稀釋度時的病毒滴度（lgFFU ／ mL）Tab.1 Virus titers（lgFFU ／mL）at various dilutions of antibodies

2.2 方法的驗證

2.2.1 特異性 RSV 可見特異性熒光，狂犬病病毒、流感病毒、風疹病毒均未見熒光，見圖3。表明該方法具有良好的特異性。

圖3 熒光顯微鏡下觀察不同病毒的特異性熒光（× 40）Fig.3 Fluorescent microscopy of specific fluorescent foci formed by various viruses（× 40）

2.2.2 線性范圍 RSV 滴度檢測的標準曲線見圖4。RSV 滴度理論值在1.70×107～5.43×103FFU／mL范圍內，與檢測值呈良好的線性關系，回歸方程為y = 1.031 3 x - 0.250 8，R2= 0.989 7。每個梯度病毒滴度3 次檢測結果RSD 均≤15%。

圖4 RSV 滴度檢測的標準曲線Fig.4 Standard curve for determination of RSV titer

2.2.3 準確性 3個濃度加標樣品的回收率均在70% ～130%范圍內，見表2。表明該方法具有良好的準確性。

表2 準確性驗證結果Tab.2 Verification for accuracy

2.2.4 重復性 同一操作人員于同一時間點對RSV A2 株（VR-1540）、RSV Long 株（VR-26）、RSV 18537 株（VR-1580）重復檢測3 次結果RSD 均≤15%，見表3。表明該方法具有良好的重復性。

表3 重復性驗證結果Tab.3 Verification for reproducibility

3 討 論

免疫熒光法主要分為直接免疫熒光和間接免疫熒光，兩種方法均可用于RSV 的臨床快速檢測［14-16］，目前，《中國藥典》三部（2020 版）［12］通則 3512 中已將免疫熒光法列為抗狂犬病病毒抗體效價的檢測方法。有文獻報道表明，采用間接免疫熒光法結合空斑法，可計算獲得RSV 滴度及抗體中和活性，但由于該方法需提前1 d 在細胞板上培養(yǎng)，實驗時長共需3 d，且儀器成本較高［14］。本實驗利用 Synagis（Palivizumab）可結合RSV 融合糖蛋白F（RSV F）的特點，用其作為一抗結合經細胞培養(yǎng)24 ～26 h 的RSV，再結合熒光標記的二抗后，可在倒置熒光顯微鏡下觀察結果，整個實驗僅需2 d，大幅縮短了實驗室檢測RSV 滴度的時間，且使用的主要儀器為倒置熒光顯微鏡，價格較低廉。

本研究對RSV 滴度檢測的間接免疫熒光法的主要影響因素（細胞接種密度及胎牛血清濃度、培養(yǎng)時間、抗體稀釋度）進行了優(yōu)化及初步驗證（特異性、線性范圍、準確性、精密性）。結果表明，最佳細胞密度為 6 × 104個 ／ 孔，血清濃度為 2.5%，培養(yǎng)時間為24 ～ 26 h，一抗稀釋度為 1 ∶1 000，二抗稀釋度為1 ∶400。特異性驗證結果表明，RSV 可見特異性熒光，狂犬病病毒、流感病毒、風疹病毒均未見熒光灶；RSV 理論滴度在 1.70 × 107～ 5.43 × 103FFU ／ mL范圍內，與檢測值呈良好的線性關系，回歸方程為y = 1.031 3 x - 0.250 8，R2= 0.989 7；3個濃度加標樣品的回收率均在70%～130%范圍內；重復性RSD均≤15%。表明該方法具有良好的特異性、線性、準確性及重復性。

綜上所述，本研究建立并驗證了用于RSV 滴度檢測的間接免疫熒光法，與空斑法及TCID50法比較，該方法檢測周期短、工作量少、結果更準確，可用于RSV 滴度的快速檢測。同時，該方法的建立也為RSV 中和抗體的檢測提供了參考。