禽呼腸孤病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能及其基因工程疫苗的研究進(jìn)展

劉媛，陳云嬌 綜述，王學(xué)理 審校

內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028042

上世紀(jì)50年代，在南非發(fā)現(xiàn)有番鴨患禽呼腸孤病毒病，1954年，Crawley 和 Fahey 首次從患有慢性呼吸道疾病的雛雞呼吸道內(nèi)分離出禽呼腸孤病毒（avian reovirus，ARV）。此后，荷蘭、日本、意大利、匈牙利等國家也先后報道了該病。1985年，王錫堃等也在我國報道了雞的呼腸孤病毒病。隨后，該病在山東、河南、廣西等地陸續(xù)被報道［1］。目前，禽呼腸孤病毒病所表現(xiàn)的癥狀越來越多樣化，在防控方面的困難也逐漸加大。

近年來，隨著我國畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，養(yǎng)禽業(yè)呈現(xiàn)集約化、規(guī)?；l(fā)展趨勢，與此同時，禽病發(fā)生的種類、范圍、病因等也發(fā)生了很大變化。新型呼腸孤病毒病主要以禽的肝臟發(fā)生不規(guī)則壞死或出現(xiàn)出血斑、出血點，心肌、腔上囊出血為主要特征［2］。呼腸孤病毒病感染譜和病理損害的變化對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展存在巨大的威脅［3］。本文對ARV 的基因組結(jié)構(gòu)和功能，以及其基因工程疫苗的研究進(jìn)展作一綜述，以期為禽呼腸孤病毒病的研究和防控提供參考。

1 基因組結(jié)構(gòu)

ARV 為呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬，不含囊膜的線性雙股 RNA（dsRNA）病毒［4-5］，其病毒粒子呈球形且為20 面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約70 ～80 nm。成熟的ARV 為含有外層衣殼和內(nèi)層衣殼的病毒粒子［6］。ARV 是由 10個雙鏈的 RNA 片段組成，這些基因片段可分為 3 組，即 L、M 和 S 類。L 類 RNA包括 3個基因片段：L1、L2、L3；M 類 RNA 包括 3個基因片段：M1、M2、M3；S 類 RNA 包括 4個基因片段：S1、S2、S3、S4［7-8］。ARV 的 10個 dsRNA 基因片段可編碼12 種蛋白，包括參與構(gòu)成病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB、σC 和不構(gòu)成成熟粒子的非結(jié)構(gòu)蛋白 μNS、p10、p17、σNS［9］。

ARV 具有較強的穩(wěn)定性，在4 ℃條件下可保存3年，37 ℃條件下可保存 15 ～ 16 周，60 ℃條件下可保存8 ～10 h。ARV 對氯仿、乙醚等均不敏感，對多種禽類的紅細(xì)胞缺乏凝集特性。

2 ARV 蛋白結(jié)構(gòu)及功能

L 類基因的 L1、L2、L3 片段分別編碼 λA、λB、λC 蛋白［10］。XU 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，ARV 的 L1 基因全長3 958 nt，該基因編碼含有1 293 aa 的λA 結(jié)構(gòu)蛋白；L2 基因編碼的λB 蛋白全長1 259 aa，相對分子質(zhì)量約140 ku；L3 基因由3 907 nt 組成，其編碼的λC 蛋白由 1 285 aa 組成。

M 類基因的 M1、M2、M3 片段分別編碼 μA、μB、μNS 蛋白。M1 基因由 2 283 nt 組成，編碼的 μA蛋白由 732 aa 構(gòu)成，相對分子質(zhì)量約 82 ku［12］；M2基因由2 158 nt 組成，編碼相對分子質(zhì)量約73 ku的 μB 蛋白；M3 基因由 1 996 nt 組成，編碼相對分子質(zhì)量約71 ku 的μNS 蛋白。

S 類基因的 S1、S2、S3、S4 分別編碼 p10、p17、σC、σA、σB、σNS 蛋白。S1 基因全長 1 643 nt，是獨一無二的功能性三順反子基因［13］。該基因含有3個相互重疊的ORF，可分別編碼p10、p17、σC 3種蛋白［14］；S2 基因全長為 1 324 nt，其編碼的 σA蛋白由 416 aa 組成，相對分子質(zhì)量約 46 ku［15］；S3 基因全長1 202 nt，編碼由367 aa 組成且相對分子質(zhì)量約 41 ku 的 σB 蛋白；S4 基因全長 1 192 nt，編碼的σNS 蛋白由367 aa 組成，相對分子量約66.2 ku。

2.1 結(jié)構(gòu)蛋白 λA 蛋白是由ARVL1 基因編碼的相對分子量約142 ku 的結(jié)構(gòu)蛋白。該蛋白同ARV的其他衣殼蛋白一起將病毒的RNA 聚合酶和基因組片段包裹住，形成了ARV 的組裝框架［16］。LIN等［17］發(fā)現(xiàn)，λA 蛋白的基因保守度非常高，在 μNS蛋白的介導(dǎo)作用下，能進(jìn)到病毒加工廠內(nèi)。

λB 蛋白是構(gòu)成病毒衣殼的成分之一，能在融合感染細(xì)胞后形成合胞體，其是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生群特異性中和抗體的抗原［18］。

λC 蛋白是病毒封閉酶。λC 蛋白貫穿病毒的內(nèi)外衣殼層，是病毒mRNA 的加帽酶。λC 蛋白在螺旋、延伸、轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲構(gòu)象上與同源哺乳動物呼腸孤病毒（mammalian reovirus，MRV）的 λ2 蛋白基本相同，均可引起感染細(xì)胞發(fā)生融合并形成合胞體。

μA 蛋白是病毒內(nèi)層衣殼的組成成分，可與λA 蛋白產(chǎn)生互作關(guān)系，且該蛋白為RNA 聚合酶（RdRp）的輔助因子。

μB 蛋白是由M2 基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒外層衣殼的主要組成結(jié)構(gòu)，參與病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程。

σA 蛋白是組成病毒內(nèi)層核衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白。該蛋白能與雙鏈DNA 進(jìn)行非特異性結(jié)合，并可通過與dsRNA 序列相結(jié)合的方式抑制蛋白激酶的活化過程，從而抑制干擾素分泌［19］。HUANG 等［20］研究表明，σA 蛋白上有抗原表位結(jié)構(gòu)存在，在臨床上可被作為血清標(biāo)記物，鑒別診斷ARV 感染。盧恒［21］采取酵母雙雜交技術(shù)選出與ARVσA 蛋白相互作用的宿主蛋白，為進(jìn)一步研究ARV 病毒分子的致病機理奠定了基礎(chǔ)。

σB 蛋白是由ARV S3 基因編碼，其開放閱讀框為 1 104 bp，由 367 aa 構(gòu)成［22］，相對分子質(zhì)量約41 ku。該蛋白是病毒外衣殼的次要組分［23］，且攜帶有特異性抗原表位，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對病毒的群特異性中和抗體并引起宿主細(xì)胞融合，除此之外該蛋白還具有提高ARV 感染細(xì)胞的能力。

σC 蛋白是由S1 基因的ORF-3 編碼的蛋白，是一種同源三聚體，可促進(jìn)宿主細(xì)胞間的黏附并誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生及分泌［24］。σC 蛋白在ARV 外層衣殼內(nèi)含量較低，但仍是構(gòu)成外層衣殼不可缺少的成分。在ARV 編碼的蛋白中，σC 蛋白攜帶有特異性抗原表位，具有良好的免疫原性，在ARV 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用［25］。σC 蛋白是ARV 中唯一能夠吸附易感細(xì)胞且能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的病毒蛋白［26］。此外，PALOMINO 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，σC蛋白不僅參與病毒附著，且可攜帶有特異性的中和反應(yīng)表面抗原，因此易受中和抗體影響。σC 編碼蛋白是所有ARV 的S 類基因中，核苷酸變異性最大的［28］，也是特異性中和抗體的唯一靶點［29］，因此σC 蛋白已成為開發(fā)抗ARV 亞單位疫苗的主要靶點。譚偉等［30］經(jīng)過對調(diào)控 p10、p17 和 σC 3 種病毒蛋白表達(dá)的相關(guān)因子的研究，發(fā)現(xiàn)了抑制ARV 在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的關(guān)鍵靶位，表明σC 蛋白可為疫苗研制的相關(guān)蛋白。

2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白 p10 是由ARV S1 基因編碼的相對分子量約10.3 ku 的非結(jié)構(gòu)蛋白，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是ARV 必要的毒力因子。其可在細(xì)胞膜上穿孔，破壞宿主細(xì)胞細(xì)胞膜，促使細(xì)胞發(fā)生融合引起合胞體形成，進(jìn)而有利于病毒擴散的作用。WU 等［31］證明，p10 蛋白是一種負(fù)責(zé)誘導(dǎo)細(xì)胞合胞體形成和凋亡的病毒素，能在宿主細(xì)胞中迅速降解，研究還發(fā)現(xiàn)，p10 的快速降解與泛素化有關(guān)。陳祥［32］通過免疫共沉淀和激光共聚焦顯微鏡檢測技術(shù)進(jìn)行的體外泛素化試驗發(fā)現(xiàn)，ARV 感染宿主細(xì)胞后，ARV 的p10 蛋白與E3 泛素連接酶Siah-1 進(jìn)行連接，起到橋梁的作用，使p10 蛋白降解，進(jìn)而抑制病毒增殖。

p17 蛋白由ARV S1 基因的第2個開放閱讀框ORF-2 編碼，是一種核質(zhì)穿梭蛋白［33］。CHIU 等［34］的研究表明，p17 蛋白通過轉(zhuǎn)錄依賴和染色體維持蛋白 1（chromosome maintenance protein 1，CRM1）的獨立機制在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間持續(xù)穿梭。李晨曦［35］的研究表明，p17 蛋白為一種多功能病毒蛋白，可通過激活10 號染色體上缺失的磷酸酶、張力蛋白和腺苷酸活化蛋白激酶，以及雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶所在自噬信號通路來觸發(fā)自噬進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制［36］。該蛋白在調(diào)控細(xì)胞周期及蛋白翻譯方向上有重要意義。

σNS 蛋白由ARV S4 基因編碼，在病毒RNA 的包裝和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。其能結(jié)合單股RNA，并且與病毒mRNA 組的基因復(fù)制有一定聯(lián)系。σNS 蛋白可在感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞漿內(nèi)形成包涵體，在病毒早期形成過程中起關(guān)鍵作用［37］。

μNS 蛋白是由ARV 的M3 基因在感染細(xì)胞中表達(dá)的異構(gòu)體，其相對分子量約71 ku。RODRIGUZE等［38］證明，μNS 蛋白是 ARV 感染過程中激活的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase3）-樣蛋白酶催化加工而成的。

3 ARV 疫苗的研究現(xiàn)狀

3.1 亞單位疫苗 在ARV 的蛋白中，σC 蛋白是ARV特異性抗體的唯一靶點，因此該蛋白也成為亞單位疫苗研制的主要蛋白。LU 等［39］以植物為研究對象免疫家禽抗ARV 感染的疫苗，將表達(dá)的σC 蛋白分別靶向于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞質(zhì)或葉綠體。外殼蛋白σC 可作為研發(fā)抗呼腸孤病毒亞單位疫苗的主要候選基因之一。李天芝等［40］通過研究發(fā)現(xiàn)，將重組σC 蛋白純化后，與ARV 的S1133 株分別對番鴨攻毒，結(jié)果顯示，重組的σC 蛋白刺激機體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，與商品化S1133 全病毒滅活苗的效果大致相當(dāng)。表明重組σC 蛋白具有較好的免疫保護(hù)效果，為ARV 亞單位疫苗的成功研制奠定了基礎(chǔ)。徐延偉［41］用法國佐劑乳化后的σC 蛋白肌肉注射21 日齡SPF 雞，4 周后進(jìn)行加強免疫，每周采血檢測抗體滴度。結(jié)果表明，σC 蛋白可阻止ARV 在體內(nèi)的復(fù)制，且能夠?qū)Ω腥静《具M(jìn)行清除。吳曉平等［42］對pET-30a-S3 ／ BL21 重組菌（σB 蛋白）與 pET-30a-S4 ORF2 ／ BL21 重組菌（σC 蛋白）進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗研究。將表達(dá)的重組蛋白經(jīng)純化和復(fù)性后，進(jìn)行油乳劑制備。將50 只1 日齡雛鴨分為5 組，每組10 只：鴨呼腸孤病毒（duck reovirus，DRV）σB 蛋白免疫組、DRV σC 蛋白免疫組、DRV σB + σC 蛋白免疫組、PBS 對照組和攻毒對照組。將重組菌皮下注射（500 μg ／ 只）雛鴨，7 d 后進(jìn)行 2 次免疫，14 d 后進(jìn)行攻毒。ELISA 法和瓊脂擴散試驗檢測抗體水平及保護(hù)指數(shù)，結(jié)果顯示，2 免后 7 d 產(chǎn)生抗體，DRV σB +σC 和 DRV σC 蛋白免疫組雛鴨血清抗體 ELISA 效價均為 1 ∶200，高于 DRV σB 蛋白免疫組（1 ∶100）。攻毒試驗結(jié)果顯示，DRV σB + σC 蛋白聯(lián)合免疫保護(hù)指數(shù)最高，為70，DRV σC 蛋白免疫組保護(hù)指數(shù)為60，DRV σB 蛋白免疫組保護(hù)指數(shù)最差，僅為 40。以上結(jié)果證明，DRV σB + σC 蛋白聯(lián)合免疫組與DRV σC 蛋白免疫組均具有良好的免疫保護(hù)性，其中DRV的 σC 蛋白與 ARV 的 σC 蛋白相似，因此 ARV 的σC蛋白也具有免疫保護(hù)性。

亞單位疫苗能夠引起機體的免疫反應(yīng)，具有很強的交叉免疫保護(hù)作用，降低了免疫副作用。

3.2 核酸疫苗 蔣慷慨［43］成功構(gòu)建了σC 蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒 pCIS3、pCIS4ORF2 和 pCIS3 + pCIS4ORF2。將其肌肉注射 2 日齡番鴨（100 μg ／ 只），免疫7 d 后用相同藥量和途徑加強免疫，加強免疫1周后，用 10-7.1934TCID50／ 0.1 mL 病毒液進(jìn)行攻毒，0.2 mL ／ 只。結(jié)果顯示，pCIS3 組對番鴨的免疫保護(hù)作用可達(dá)80%，pCIS4ORF2 組可產(chǎn)生90%的免疫保護(hù)作用，pCIS3 + pCIS4ORF2 組對番鴨的免疫保護(hù)作用可達(dá)100%。表明構(gòu)建的σC 蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒對番鴨有較好的免疫保護(hù)效果。

3.3 活載體疫苗 活載體疫苗是最具發(fā)展空間的疫苗之一。該疫苗作用效果好、較穩(wěn)定且免疫方法簡單。萬俊杰［44］構(gòu)建了能表達(dá)σC 蛋白基因的重組減毒沙門菌 SL7207（pVAX-σC）、SL7207（pVAXAB-σB-σC），以 1.0 × 109CFU 劑量免疫雛雞，結(jié)果顯示，經(jīng)過免疫后能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高的ARV σC 蛋白的特異血清抗體，且 SL7207（pVAX-σC）比 SL7207（pVAXAB-σB-σC）能更好地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性中和抗體。王存?zhèn)ィ?5］構(gòu)建了ARVσC 基因重組減毒沙門菌，應(yīng)用雛雞對其進(jìn)行檢測，證明疫苗安全、穩(wěn)定。以上試驗表明，σC 蛋白具有與ARV 相同的免疫活性，以該蛋白為核心研制的活載體疫苗在臨床上有良好的免疫效果。

4 展 望

研制疫苗防控禽呼腸孤病毒病是既經(jīng)濟又有效的手段，但傳統(tǒng)疫苗在安全性、有效性等方面存在些許缺陷。近年來，ARV 基因工程疫苗的研制取得了較大進(jìn)步，目前已有多種疫苗應(yīng)用于臨床試驗中。在ARV 疫苗研制中，σC 蛋白起到重要作用，成為疫苗研制的候選基因。對ARV 結(jié)構(gòu)蛋白的免疫保護(hù)性進(jìn)行不斷的研究和探索，將會為其基因工程疫苗的成功研制奠定一定的理論基礎(chǔ)，從而全面、有效地防控禽呼腸孤病毒病。