多糖結(jié)合疫苗技術(shù)評價常見藥學(xué)問題淺析

楊丹，李敏

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022

多糖結(jié)合疫苗為莢膜多糖與載體蛋白共價結(jié)合形成的復(fù)合物，其選用的載體蛋白使多糖由T 細胞非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門 細胞依賴性抗原，增強了多糖的免疫原性，能夠有效改善多糖疫苗不能在2歲以下兒童、老年人及免疫缺陷者等易感人群體內(nèi)激發(fā)有效免疫應(yīng)答的問題［1］。

我國已上市多糖結(jié)合疫苗有：13 價肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗、A群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗、ACYW135群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗（CRM197 載體）、b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗及包含該組分的聯(lián)合疫苗。多糖結(jié)合疫苗是近年的研發(fā)熱點，以肺炎多糖結(jié)合疫苗為例，2018—2021年共有2個國產(chǎn)13 價肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗獲批上市，6個獲批臨床，另外，還有20 價、24 價肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗獲批臨床。2021年，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)美國默沙東公司的15 價肺炎結(jié)合疫苗和美國輝瑞公司的20 價肺炎結(jié)合疫苗用于18歲以上成年人群。隨著多糖結(jié)合疫苗新工藝的研發(fā)及新分析方法的應(yīng)用，研究過程中還存在一些需要討論的問題。本文對技術(shù)評價關(guān)注的藥學(xué)問題進行了梳理，以期為多糖結(jié)合疫苗研發(fā)、生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量提升提供借鑒。

1 生產(chǎn)工藝

多糖結(jié)合疫苗生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，可能涉及細菌發(fā)酵、多糖純化、水解、衍生、活化、結(jié)合等多個工藝步驟和生產(chǎn)階段，生產(chǎn)、控制和產(chǎn)品質(zhì)量及批間一致性等方面受影響的因素較多［2］。由于多糖結(jié)合疫苗高度依賴工藝路線和工藝控制，多個質(zhì)量屬性可能在較大范圍內(nèi)波動，除參考ICH 藥物研發(fā)（Q8）、質(zhì)量風(fēng)險管理（Q9）和藥品質(zhì)量系統(tǒng)（Q10）指導(dǎo)原則［3-5］，在對物料屬性、工藝路線及工藝參數(shù)等進行常規(guī)篩選研究的基礎(chǔ)上，建議工藝研發(fā)過程中開展更多研究，確證工藝參數(shù)對質(zhì)量屬性的影響，加強工藝控制，確保批間一致性及工藝耐用性。

工藝開發(fā)過程中，在常規(guī)放行檢測基礎(chǔ)上，建議對不同工藝步驟產(chǎn)物（多糖、降解產(chǎn)物、衍生物、結(jié)合物原液等）分子量大小、有效官能團含量進行檢測，分析工藝過程是否對多糖的主要抗原結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著不利影響，為工藝路線及參數(shù)的合理化提供更多依據(jù)。部分品種在項目研發(fā)過程中以理化指標(biāo)、動物免疫原性等為考察指標(biāo)對衍生率、結(jié)合物分子大小、游離多糖含量等關(guān)鍵工藝參數(shù)范圍、質(zhì)量屬性范圍進行較為充分的工藝研究及表征，以確保在擬定工藝參數(shù)范圍及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)生產(chǎn)產(chǎn)品的安全性、有效性具有可比性。

多糖結(jié)合疫苗涉及中間產(chǎn)物較多，應(yīng)建立較全面的過程控制，其中對于中間體是否開展必要的放行檢測存在不同考慮。部分研發(fā)者認為多糖降解產(chǎn)物不是關(guān)鍵中間體，較多的過程控制給質(zhì)控體系帶來較大負擔(dān)，僅需進行過程中工藝操作參數(shù)的控制。筆者認為，考慮降解多糖分子大小與后續(xù)生產(chǎn)及產(chǎn)物免疫原性密切相關(guān)，同時參考已上市品種質(zhì)控，建議在研發(fā)及上市的早期階段至少對降解多糖分子大小進行放行檢測。

另外，建議根據(jù)多糖結(jié)合疫苗產(chǎn)品和工藝的特點開展全面的生產(chǎn)工藝驗證，除對相關(guān)樣品進行過程控制及放行檢測外，還應(yīng)對各純化步驟中工藝相關(guān)雜質(zhì)、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)去除效果及目標(biāo)產(chǎn)物回收率進行較全面地研究，開展系統(tǒng)的多糖降解、活化、多糖-蛋白結(jié)合的動力學(xué)曲線研究，在制劑工藝驗證中開展各型別結(jié)合物吸附率及吸附動力學(xué)曲線研究等。WHO 在肺炎多糖-蛋白結(jié)合疫苗指導(dǎo)原則中指出，應(yīng)證明每批次化學(xué)修飾后的多糖或載體蛋白上均不含活化的功能團，或可監(jiān)測封閉反應(yīng)的產(chǎn)物或檢測封閉反應(yīng)以顯示未發(fā)生反應(yīng)功能團的去除情況［6］。因此，建議在工藝驗證中進行非結(jié)合活化位點檢測及去除效果的相關(guān)研究。

2 半成品配制及產(chǎn)品規(guī)格

《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定，對半成品配制點的控制應(yīng)選擇與有效性相關(guān)的參數(shù)進行測定，半成品配制時應(yīng)根據(jù)有效成分測定方法的誤差、不同操作者間及同一操作者不同次操作間的誤差綜合確定配制點［7］。但在技術(shù)評價過程中發(fā)現(xiàn)多家企業(yè)多糖結(jié)合疫苗半成品配制存在預(yù)配制過程，即在預(yù)配制過程中根據(jù)檢測結(jié)果進一步調(diào)整配制點，以滿足最終成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。該操作難以確保每批產(chǎn)品的投料量一致，與藥典要求不符，且難以確保上市產(chǎn)品的安全有效性。建議企業(yè)從前期研發(fā)起始就按照相關(guān)要求開展科學(xué)規(guī)范的研究，上市批次的半成品配制點、投料量均需與關(guān)鍵性臨床批次保持一致。

已上市的多糖或多糖結(jié)合疫苗規(guī)格描述存在兩種情形，大部分品種規(guī)格與配制點一致，如ACYW135多糖疫苗；個別品種與成品多糖含量標(biāo)準(zhǔn)下限一致，如b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗。規(guī)格與配制點不一致部分系歷史遺留問題，近年批準(zhǔn)的產(chǎn)品規(guī)格均采用了與國際規(guī)范一致的描述，即規(guī)格與配制點一致。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)以配制點為目標(biāo)值擬定上下限。上下限應(yīng)結(jié)合多糖含量檢測結(jié)果及穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)，綜合考慮方法學(xué)的變異情況后，擬定為配制點的上下浮動，品種規(guī)格應(yīng)與配制點一致。

3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

國內(nèi)外藥典及WHO 指導(dǎo)原則中已對多糖結(jié)合疫苗各中間產(chǎn)物及成品質(zhì)量控制提出基本要求，企業(yè)應(yīng)根據(jù)品種自身工藝特點及穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)進一步合理擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，原則上應(yīng)不低于國家標(biāo)準(zhǔn)及已上市的同類產(chǎn)品。本文對于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項目的設(shè)置不做過多討論，主要對多糖結(jié)合疫苗技術(shù)評價中常見的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)問題進行梳理和討論。

3.1 分子大小檢測

3.1.1 檢測方法 《中國藥典》三部（2020 版）中規(guī)定，ACYW135 群腦膜炎球菌多糖疫苗成品、A 群C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗結(jié)合物原液等多糖分子大小分布測定采用“通則3419”方法［7］。部分品種結(jié)合物原液直接采用“通則3419”中的CL-4B 凝膠色譜柱檢測分子大小分布，但多批產(chǎn)品檢測結(jié)果及方法學(xué)驗證資料顯示，分配系數(shù)（partition coefficient，Kd）值基本均為0，即待測樣品基本被排阻于凝膠顆粒之外，未進入凝膠內(nèi)水，未得到待測樣品有效分離的分布數(shù)據(jù)。目前各企業(yè)多糖結(jié)合疫苗選用載體不同，如破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）、白喉類毒素（diphtheria toxoid，DT）、白喉毒素的無毒變異體（crossreactive material 197，CRM197）、重組肺炎球菌溶血素（recombinant pneumolysin，rPly）等；生產(chǎn)工藝也存在較大差異，如多糖是否降解、不同結(jié)合工藝路線，因此，最終制備的結(jié)合物原液分子大小也不同，企業(yè)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品自身特點開發(fā)可客觀反映分子量大小及分布情況、利于批間一致性控制的質(zhì)控方法，如Sepharose CL-2B、HPLC、HPLC-MALLS、SEC-MALLS 法等，推薦使用高效液相色譜方法，但需驗證所用方法在適當(dāng)?shù)姆肿恿糠秶鷥?nèi)具有足夠的分離度。另外，目前部分申報臨床的品種已將SEC-MALLS、HPLC-RI 法等作為分子大小及分布放行檢測方法，屬于技術(shù)評價予以鼓勵的方向。但為與藥典標(biāo)準(zhǔn)有效銜接，建議臨床試驗期間同時使用以上方法與CL-4B（或CL-2B）法進行分子大小及分布檢測，積累數(shù)據(jù)并分析兩種方法的相關(guān)性。

3.1.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 分子大小分布中Kd 界值選擇至關(guān)重要，不同的Kd 界值對應(yīng)回收率的批間一致性會存在較大差異，不適宜的Kd 值雖會呈現(xiàn)表觀穩(wěn)定的回收率，但掩蓋了實際產(chǎn)品的批間差異。建議企業(yè)對不同Kd 界值的回收率進行統(tǒng)計，最終確定的Kd 界值應(yīng)能較敏感地反映產(chǎn)品批間一致性，同時推薦對50%峰面積對應(yīng)的Kd 值進行相關(guān)研究并積累數(shù)據(jù)。

3.2 多糖含量檢測 多糖結(jié)合疫苗結(jié)合物原液中一般采用化學(xué)法檢測多糖含量，成品中由于化學(xué)法無法對各型多糖進行區(qū)分，多采用免疫法進行多糖含量檢測，如速率比濁法。化學(xué)法和免疫法的多糖含量檢測結(jié)果存在系統(tǒng)差異，因此，導(dǎo)致部分品種出現(xiàn)成品多糖含量不能滿足“配制點± 30%”的相關(guān)要求。建議企業(yè)在前期研發(fā)中對兩種方法的相關(guān)性進行充分研究及數(shù)據(jù)積累，避免因檢測方法導(dǎo)致上市申報批次與關(guān)鍵臨床批次配制點存在差異，從而需要更多的免疫原性數(shù)據(jù)進行支持性評價。

速率比濁法檢測多糖含量的原理為多糖與相對應(yīng)血清群的抗體發(fā)生反應(yīng)后形成抗原抗體復(fù)合物，復(fù)合物含量與散射光強度成正比［8-9］。檢測用血清的制備工藝和質(zhì)量控制存在差異，可能存在不同血清型間的交叉干擾，對單價原液多糖含量檢測影響不大，但用于多價成品檢測時會導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此在產(chǎn)品開發(fā)過程中應(yīng)關(guān)注多糖含量免疫法檢測的特異性驗證及其型特異血清的標(biāo)定和質(zhì)控，建議對檢測血清進行篩選及評價；另外，需關(guān)注不同批次檢測血清可能存在的批間差異，并確保血清替換時的可溯源性，該差異可能會導(dǎo)致成品多糖含量檢測結(jié)果超標(biāo)，建議盡可能在研發(fā)早期建立足夠的標(biāo)準(zhǔn)血清庫。

另外，部分品種采用化學(xué)法對特異性官能團含量進行檢測，對不同型別多糖同時含有同一官能團的情況，應(yīng)確認檢測方法的準(zhǔn)確性，必要時進行相關(guān)系數(shù)的校正，建立相應(yīng)的計算方法。

3.3 游離多糖含量檢測 結(jié)合多糖是免疫學(xué)上對臨床保護作用具有重要意義的成分，如游離多糖的含量過高，可能使機體產(chǎn)生相應(yīng)抗原的低免疫應(yīng)答［10］，影響其臨床保護效果。各企業(yè)雖采用不同方法對游離多糖和結(jié)合多糖進行分離，如脫氧膽酸鈉法、高鹽高醇析出法、氫氧化鋁凝膠結(jié)合法等，但均采用與結(jié)合物原液多糖含量相同的檢測方法進行檢測。部分品種在游離多糖方法學(xué)準(zhǔn)確度驗證中，其標(biāo)準(zhǔn)品加入濃度遠高于實際游離多糖濃度，建議采用與結(jié)合物原液游離多糖實際濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品進行準(zhǔn)確度驗證，同時應(yīng)設(shè)立游離多糖試驗成功的條件，如每次沉淀游離多糖的回收率要求等。

3.4 結(jié)合抗原（bound antigenicity）及結(jié)合蛋白（bound protein）含量檢測 含鋁佐劑的多糖結(jié)合疫苗制備過程中需考慮佐劑對結(jié)合物及載體蛋白的吸附狀態(tài)的質(zhì)控，因此將結(jié)合抗原及結(jié)合蛋白檢測納入產(chǎn)品質(zhì)控。目前各產(chǎn)品對上述兩個指標(biāo)所用檢測方法原理不同，部分產(chǎn)品以鋁佐劑吸附的多糖、載體蛋白量為結(jié)合態(tài)（分離鋁佐劑吸附與未吸附的組分進行檢測），部分產(chǎn)品以多糖蛋白結(jié)合物（對待測樣品進行鋁佐劑解吸附處理，再檢測分離游離態(tài)組分和結(jié)合態(tài)組分）為結(jié)合態(tài)，雖然上述兩種結(jié)合態(tài)均為吸附率和結(jié)合率的綜合體現(xiàn)，但考慮佐劑吸附率與免疫原性直接相關(guān)，建議在產(chǎn)品開發(fā)過程中開展各型別結(jié)合物吸附率的相關(guān)研究。

3.5 載體蛋白純度檢測 多糖結(jié)合疫苗是以多糖為抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答［11］，應(yīng)盡可能避免載體蛋白引起的非預(yù)期的免疫原性，由于免疫機制存在差異，載體蛋白的質(zhì)控要求也與其作為疫苗組分的質(zhì)控存在不同。以TT 載體蛋白為例，除抗原含量相關(guān)純度（以絮狀單位表述）外，建議對單體含量進行質(zhì)控。方法學(xué)驗證中應(yīng)關(guān)注所選用方法是否可充分分離載體蛋白單體、聚體，同時建議進行各峰歸屬解析等研究。

4 穩(wěn)定性

為全面考察多糖結(jié)合疫苗在貯存條件下的穩(wěn)定性，確保其效期制定的科學(xué)、合理，建議在穩(wěn)定性考察中增加效力檢測，但需采用合理的免疫劑量。由于多糖結(jié)合疫苗涉及的中間產(chǎn)物較多，考慮多個中間產(chǎn)物多步長期保存的方式不利于產(chǎn)品質(zhì)量的可控性，建議進行各階段中間產(chǎn)物累計存放最長時間制備成品批次的穩(wěn)定性研究。為更好地對臨床期間變更或上市后變更進行可比性研究，各中間產(chǎn)物除長期穩(wěn)定性外均應(yīng)開展加速穩(wěn)定性研究。

5 小 結(jié)

保障安全性和有效性是多糖結(jié)合疫苗藥學(xué)研發(fā)的核心考慮要點。現(xiàn)代分子技術(shù)和方法的開發(fā)應(yīng)用，為多糖結(jié)合疫苗的工藝開發(fā)、結(jié)構(gòu)確證和質(zhì)量控制提供了越來越多的技術(shù)支持，鼓勵企業(yè)在對產(chǎn)品充分研究的基礎(chǔ)上對生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行優(yōu)化。本文對既往多糖結(jié)合疫苗技術(shù)評價中的藥學(xué)共性問題進行了梳理，以期為同類產(chǎn)品的研發(fā)、申報及審評提供參考。