伊犁地區(qū)牛源大腸埃希菌血清分型和ERIC-PCR分型研究

劉英玉，張 妍，劉俊飛，吾買爾江·牙合甫，張曉紅，姚 剛*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.昌吉天康畜牧科技有限公司，新疆昌吉 831100)

大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)在自然界中廣泛存在，其抗原十分復雜，且變異性大，肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中大腸埃希菌污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是糞便、飼草料、屠宰加工環(huán)節(jié)，通過鑒定某地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中大腸埃希菌的血清型和優(yōu)勢基因型，為該地區(qū)大腸埃希菌病的防治提供科學數(shù)據(jù)。目前常采用大腸埃希菌O抗原血清來進行血清分型，常用的血清學檢測方法有玻片凝集試驗、乳膠凝集試驗和ELISA。玻片凝集試驗是通過抗血清與抗原發(fā)生凝集反應，從而鑒定其血清型。郝彥龍等[1]報道新疆北疆地區(qū)致犢牛腹瀉大腸埃希菌的優(yōu)勢血清型為O101、O6、O114和O78。不同地域和不同時間段的大腸埃希菌血清型存在差異。表型易受環(huán)境變化而發(fā)生變異，從而給菌株分型鑒定帶來困難，可用基因分型方法獲得指紋圖譜，從而確定菌株之間的親緣關(guān)系。莊孝飛等[2]證實，腸桿菌基因間重復共有序列-聚合酶鏈反應(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR)對不同血清型具有快速、高效分型的優(yōu)勢，同時90株不同來源腸炎沙門菌也闡釋了ERIC-PCR對高同源性血清型菌株亞型分型的局限性。ERIC-PCR對于確定暴發(fā)流行，追蹤傳染源及可能的傳播途徑，確定同一病人反復感染是源于復發(fā)或再感染，明確某一菌株與某些臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，增強對感染性疾病的流行病學認識等方面有重要意義。本研究對伊犁地區(qū)某規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖場飼草料和糞便及屠宰加工環(huán)節(jié)中分離鑒定的224株大腸埃希菌采用O抗原多價血清進行初步檢測，然后對多價4和多價5的大腸埃希菌進行單價PCR(O7、O39、O5、O114、O116、O6、O9、O30、O55)的擴增，同時進行ERIC-PCR的基因分型。從整體上分析伊犁地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中牛源大腸埃希菌的優(yōu)勢血清型分布情況，對比分析PCR檢測多價4和多價5大腸埃希菌中血清型和基因分型的存在情況和遺傳關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌CICC21530標準株，新疆農(nóng)業(yè)大學動醫(yī)學院況玲教授提供；試驗菌株224株，均為前期試驗[3]分離鑒定所得，其中糞樣中大腸埃希菌164株，飼草料中腸埃希菌48株，屠宰加工環(huán)節(jié)樣品[操作用具(刀、圍裙、手、傳送帶)，胴體表面，牛肉]中大腸埃希菌12株。

1.1.2 主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；YJ-875醫(yī)用凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品；THZ-02型臺式恒溫振蕩器，中國科學院新疆分院科學儀器廠產(chǎn)品；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；Bio-rad T100梯度PCR儀、移液器、高速離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；三洋制冰機，日本三洋有限公司產(chǎn)品；微波爐，廣東美的電器有限公司產(chǎn)品；電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；水平電泳槽、DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；TaqMasterMix、DNA 100 Marker、瓊脂糖等，新疆偉博鑫生物有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠(EB)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司產(chǎn)品。O抗原多價血清，天津生物芯片技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 大腸埃希菌的檢出率較高，參考GB/T18869—2002和GB/T4789.3—2016進行分離，在伊紅美藍培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂中進行鑒定和純化[3]。

1.2.2 玻片凝集試驗 制備濃稠菌懸液，采用玻片凝集試驗檢測牛源大腸埃希菌分離菌株的21種O抗原多價血清。同時做生理鹽水對照。1 min～2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應，呈均勻渾濁者為陰性。

1.2.3 PCR檢測

1.2.3.1 PCR擴增引物和試劑 引物參考Atsushi的單價血清PCR引物設(shè)計方法[4]，參照曹蕓[5]的ERIC-PCR引物設(shè)計方法，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成(表1)，用1×TAE(10 mmol/L Tri-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0)稀釋引物為使用濃度10 μmol/L或20 μmol/L。

1.2.3.2 PCR檢測 采用煮沸法制備細菌DNA模板，離心后收集上清。PCR反應體系共25 μL：TaqMaster Mix 12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，細菌DNA 2 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。PCR反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物保存于16℃。

ERIC-PCR 反應體系25 μL：12.5 μLTaqMaster Mix，1.5 μL 20 μmol/L ERIC1R，1.5 μL 20 μmol/L ERIC2，2 μL模板，7.5 μL滅菌雙蒸水。反應條件：94 ℃ 5 min;94℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2min，共35個循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應。

表1 單價血清PCR引物序列和ERIC-PCR引物序列及擴增長度

注：-.無此項內(nèi)容。

Note: -.None of this content.

1.2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓180 V。ERIC-PCR產(chǎn)物于1.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓70 V。凝膠用EB染色，通過凝膠成像系統(tǒng)進行拍照并掃描保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Bio Numerics軟件的非加權(quán)配對平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)對ERIC-PCR指紋圖譜進行分析，條件位置差異容許度選擇1.5%，優(yōu)化值1.5%，相似系數(shù)使用Dice系數(shù)(F值)表示。公式為：F=2nxy/(nx+ny)。其中，nx表示菌株X的條帶數(shù)，ny表示菌株Y的條帶數(shù)，nxy表示菌株X和Y相同的電泳條帶數(shù)，F(xiàn)值得數(shù)在0～1之間，值越大則表示同源程度越高。同源度80%以上者為同一亞型，小于80%者為不同的基因亞型[6-7]。

2 結(jié)果

2.1 O抗原多價血清菌株檢測

用大腸埃希菌O抗原多價血清分別檢測糞樣中大腸埃希菌164株、飼草料中大腸埃希菌48株及屠宰加工環(huán)節(jié)樣品中大腸埃希菌12株的血清型，檢測結(jié)果顯示，菌株存在較多的交叉血清型約50余株。有51株未檢出血清型，占O抗原多價血清檢出的18.40%(圖1)。檢測的大腸埃希菌以多價1和多價4、多價5、多價6、多價14、多價15、多價18、多價19的菌株較多，其中多價4、多價5、多價6、多價19均超過5%的檢測率。

圖1 牛源大腸埃希菌多價O抗原血清型的檢出率

2.2 單價血清型PCR擴增多價4的檢測

用O7、O39、O5、O114、O116血清型的引物分別擴增多價4血清型的16株大腸埃希菌，根據(jù)PCR檢測的目的條帶大小來判定。O7血清型的引物和O39血清型的引物沒有擴增出陽性條帶。O5血清型的引物擴增出目的條帶大小為566 bp，多價4的菌株中有2株菌(262n、354n)擴增出目的條帶大小為566 bp的DNA片段(圖2A)。O114血清型的引物擴增出目的條帶大小為553 bp，多價4的菌株中有3株菌(69n、203n、262n)擴增出目的條帶大小為553 bp的DNA片段(圖2B)。O116血清型的引物擴增出目的條帶大小為156 bp，發(fā)現(xiàn)多價4的菌株中有4株菌(203n、32n、105s、56s)擴增出目的條帶大小為156 bp的DNA片段(圖2C)。

2.3 單價血清型PCR擴增多價5的檢測

用O6、O9、O30、O55引物分別擴增多價O抗原血清O5的22株菌，根據(jù)PCR檢測的目的條帶大小來判定。O6血清型的引物擴增出目的條帶大小為783 bp(圖3)，多價5的菌株中有6株菌(262n、220n、73n、28n、354n、69n)擴增出目的條帶大小為783 bp的DNA片段。O9血清型的引物擴增出目的條帶大小為1 235 bp，多價5的菌株中有2株菌(295n和69n)擴增出目的條帶大小為1 235 bp的DNA片段(圖3)。其中菌株69n屬于交叉血清型，同時擴增出血清型的O6和O9。O30和O55血清型的引物沒有擴增出目的條帶。

2.4 多價4和多價5大腸埃希菌的ERIC-PCR基因分型圖譜

將O抗原多價4和多價5血清型的38株大腸埃希菌進行ERIC-PCR擴增、電泳。ERIC-PCR指紋圖譜顯示有7株菌株沒有擴增出條帶，其他菌株擴增出2條～6 條條帶，大小在250 bp～2 000 bp，產(chǎn)生的DNA 指紋圖譜呈現(xiàn)出多態(tài)性(圖4和圖5)。

A.O5;B.O114;C.O116;M.DNA 標準DL 2 000;N.陰性對照;1.354n;2.203n;3.32n;4.105S;5.56S

A.O5;B.O114;C.O116;M.DNA Marker DL 2 000;N.Negetive control；1.354n;2.203n;3.32n;4.105S;5.56S

圖2引物擴增的目的條帶

Fig.2 The target bands of primers amplification

M.DNA 標準DL 2 000;N.陰性對照;1.295 n;2.354 n

M.DNA Marker DL 2 000;N.Negetive control；1.295 n;2.354 n

圖3血清型O6和O9大腸埃希菌引物擴增的目的條帶

Fig.3 The target bands of O6 and O9E.coliserotypes by primers amplification

2.5 多價4和多價5大腸埃希菌的ERIC-PCR基因分型進化分析

將產(chǎn)生的DNA指紋圖譜去除6株交叉血清型，通過Bio Numerics軟件繪制成UPGMA聚類樹產(chǎn)生了25種DNA指紋圖，并進行遺傳進化關(guān)系分析(圖6)。25株多價4和多價5血清型的大腸埃希菌有13種基因型，分成6簇，相似性在59%～100%。同種多價在一個簇，D簇包括12株菌，同源性在70%以上。加工環(huán)節(jié)5-w與糞便72n的同源性為100%，其來源相同菌株。而加工環(huán)節(jié)R-21與其他簇的菌株之間相似性小于40%，其親緣關(guān)系最遠。

3 討論

在大腸埃希菌O抗原多價血清型檢測過程中，有些菌株的O抗原能夠與O抗原多價血清產(chǎn)生凝集反應，且在進行O抗原單價血清型的PCR檢測過程中，也存在一些菌株能夠同時擴增出多個目的條帶。在鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)有些菌株的O抗原能夠與多個單因子血清進行凝集反應，這和王文豪等[8]報道的一致。與多個多價血清發(fā)生凝集的菌株可能存在多種表面抗原，且這些表面抗原可能具有某種共同的特性。據(jù)報道，銀川地區(qū)的奶牛中存在較多O10、O53、O92、O101、O158 血清型的大腸埃希菌，內(nèi)蒙古奶牛場糞便樣品中大腸埃希菌以O(shè)18、O146和O152為優(yōu)勢血清型，新疆北疆地區(qū)致犢牛腹瀉中大腸埃希菌以O(shè)101、O6、O114、O78為優(yōu)勢血清型[1]。伊犁地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中大腸埃希菌多價O血清以多價1和多價4、多價5、多價6、多價14、多價15、多價18、多價19為主，不同血清型的大腸埃希菌污染存在差異。其中多價4和多價5的菌株中以O(shè)5、O114、O116、O6和O9血清型為主。與新疆地區(qū)報道的犢牛腹瀉優(yōu)勢血清型的檢測結(jié)果存在相同血清型，但是個別菌株存在交叉血清型。

ERIC-PCR是目前常用的一種簡便、快速的基因分型技術(shù)，其分辨率較強，結(jié)果可與細菌分子生物學分型技術(shù)的“金標準”PFGE分型有一定相關(guān)性[9-10]。在PFGE、Sau-PCR、ERIC-PCR等方法中，ERIC-PCR花費的時間和成本最低，是基層單位進行初期溯源分型的首選方法[11]。Warriner K等[12]成功地應用ERIC-PCR來追蹤豬肉屠宰加工線上大腸埃希菌的污染源頭。Wang H等[13]也成功地應用ERIC-PCR追蹤了雞肉屠宰加工線上沙門菌的污染源頭。高宇等[14]應用ERIC-PCR技術(shù)分析了湖北省患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物分離的91株嗜水氣單胞菌在各個地區(qū)之間的親緣關(guān)系和基因多樣性。本文中部分菌株沒有擴增出ERIC-PCR指紋圖譜，Bio Numerics軟件分析多價4和多價5大腸埃希菌的遺傳進化關(guān)系呈現(xiàn)多樣性。多價4和多價5大腸埃希菌存在13種基因型，同源性在59%～100%，可以分成6簇。整體上同種多價在一個簇，D簇有12株菌，同源性在70%以上。通過分析可以發(fā)現(xiàn)ERIC-PCR基于基因組上的特定重復序列能夠很好地把不同來源的大腸埃希菌進行區(qū)分和歸類，進而達到溯源的目的。本研究發(fā)現(xiàn)多價4和多價5菌株以O(shè)5、O114、O116、O6和O9的同種血清型的不同菌株其基因型不在一個簇內(nèi)，即某地區(qū)的是同種血清型其基因型存在差異是不同的。

M.DNA標準DL 1 500； 1～14、16、17.大腸埃希菌多價4血清型的ERIC-PCR指紋圖譜；15.大腸埃希菌檢測出的O157的ERIC-PCR指紋圖譜

M.DNA Marker DL1 500； 1-14,16,17.E.colipolyvalent 4 serotypes of ERIC-PCR fingerprinting;15.O157E.colipolyvalent 4 serotypes of ERIC-PCR fingerprinting

圖4大腸埃希菌O抗原多價4的ERIC-PCR指紋圖譜

Fig.4 ERIC-PCR fingerprint of polyvalent 4 ofE.coliO antigen

M.DNA標準DL 1 500； 18～34.大腸埃希菌多價5血清型的ERIC-PCR指紋圖譜

M.DNA Marker DL 1 500;18-34.E.colipolyvalent 5 serotypes of ERIC-PCR fingerprinting

圖5大腸埃希菌O抗原多價5的ERIC-PCR指紋圖譜

Fig.5 ERIC-PCR fingerprint of polyvalent 5 ofE.coliO antigen

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