實驗用小尾寒羊脊柱外科手術(shù)圍手術(shù)期管理的探討

張 闊，孫海明，田 楓*，司 雨，楊 辰，林國忠，韓 婕，鄭振輝

(1.北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，北京 100191；2.北京大學第三醫(yī)院，北京 100191；3.北京積水潭醫(yī)院，北京 100035)

實驗動物是生命科學研究和發(fā)展中重要的基礎(chǔ)和支撐條件，科研人員進行動物實驗建立動物模型是醫(yī)學基礎(chǔ)研究中不可或缺的重要組成部分[1]。當基因修飾動物模型及化學和物理方法造模不能達到預(yù)期動物模型效果時，外科手術(shù)制作動物模型是不可替代的重要手段。通過實驗外科方法制作疾病動物模型，對于疾病的基礎(chǔ)研究和臨床研究具有不可替代的意義[2]。小尾寒羊頸椎與人頸椎在解剖結(jié)構(gòu)、運動特點、椎骨密度及生物力學等諸多方面有很多相似性，非常適合進行人頸椎相關(guān)疾病的研究[3]。小尾寒羊在脊柱外科研究中的應(yīng)用越來越廣泛，對揭示頸椎病理變化、制定治療方案及提高治療效果發(fā)揮了重要的作用。近年來我們共進行了百余例小尾寒羊的外科動物實驗，其中包括頸部脊髓壓迫模型、人工椎體植入、頸椎椎板切除模型、腰椎體間融合模型及頸部椎體手術(shù)方式等脊柱外科相關(guān)實驗。實施規(guī)范化圍手術(shù)期管理是小尾寒羊脊柱外科手術(shù)成功的前提與保障。本文結(jié)合本部多年來進行小尾寒羊脊柱手術(shù)圍手術(shù)期的管理經(jīng)驗及處理要點，旨在為從事相關(guān)動物實驗人員提供有益的經(jīng)驗與借鑒。

1 術(shù)前管理

1.1 保證動物福利

實驗人員在實驗開始前必須向?qū)嶒瀯游锔＠麄惱砦瘑T會提交正式申請書。申請書包括以下內(nèi)容：動物實驗項目名稱及概述，項目負責人、執(zhí)行人的姓名、專業(yè)背景簡歷、實驗動物從業(yè)人員培訓(xùn)證書編號、環(huán)境設(shè)施許可證號、項目的意義、項目的必要性、項目中有關(guān)實驗動物的用途、飼養(yǎng)管理及實驗處置方法、預(yù)期出現(xiàn)的對動物造成的傷害、處死動物的方法、項目進行中涉及動物福利和倫理問題的詳細描述，遵守實驗動物福利倫理原則的聲明。北京大學生物醫(yī)學倫理委員會實驗動物福利倫理分會在實驗動物福利倫理審查中根據(jù)如下的基本原則進行審查：審查動物實驗的必要性，對實驗?zāi)康?、預(yù)期利益與造成動物的傷害、死亡等進行綜合的評估。保證實驗動物生存時包括運輸中享有最基本的權(quán)利，享有免受饑渴、生活舒適自由，享有良好的飼養(yǎng)和標準化的生活環(huán)境，各類實驗動物管理要符合該類實驗動物的操作技術(shù)規(guī)程。應(yīng)充分考慮動物的利益，善待動物，減少動物的應(yīng)激，尊重動物生命，制止針對動物的野蠻行為、采取痛苦最少的方法處置動物。實驗動物項目要保證從業(yè)人員的安全，動物實驗方法和目的符合人類的道德倫理標準和國際慣例。在本部進行小尾寒羊脊柱手術(shù)相關(guān)的醫(yī)學動物實驗，均由北京大學生物醫(yī)學倫理委員會實驗動物福利倫理分會進行審查經(jīng)批準同意后方可進行實驗，而且必須嚴格按動物倫理審批項目的規(guī)定執(zhí)行[2]。

1.2 人畜共患病檢測及控制

小尾寒羊?qū)儆谠囼炗脛游锊⒎菢藴蕦嶒瀯游?，目前關(guān)于試驗用羊尚無國家標準和地方標準可依。羊的人畜共患病有炭疽、布魯菌病、口蹄疫、鉤端螺旋體等多種疫病。2010年某高校師生在羊活體解剖學實驗課中感染布魯菌的事件為實驗動物從業(yè)人員敲響了警鐘，提示在實驗外科相關(guān)動物實驗中應(yīng)有效防控實驗用動物的人畜共患疾病[4]。因此，在用羊進行動物實驗前，應(yīng)進行布魯菌病等人畜共患疾病檢測，以保證實驗人員的安全。布魯菌的平均潛伏期是2周至幾個月不等，羊在訂購后，應(yīng)單獨圈養(yǎng)，隔離觀察。分別在訂購時、飼養(yǎng)場隔離觀察時及進駐實驗單位前進行3次布魯菌病等人畜共患疾病檢測及驅(qū)除體內(nèi)外寄生蟲。3次術(shù)前檢疫后，為了保障實驗動物從業(yè)人員的安全，術(shù)后還應(yīng)進行術(shù)后定期監(jiān)測，以每2周～6周監(jiān)測1次為宜，每次檢測均應(yīng)由有資質(zhì)的檢測機構(gòu)出具正式檢測報告。我們通過人畜共患疾病的檢測篩選出符合實驗要求的小尾寒羊，有效的保證了試驗用羊的質(zhì)量，從而為開展小尾寒羊的動物實驗提供安全保障。只有制定嚴格的隔離檢疫制度并及時檢測人畜共患疾病，才能避免嚴重感染事件的發(fā)生[5]。

1.3 動物健康檢查

小尾寒羊應(yīng)在手術(shù)前2周～4周進駐動物實驗中心，適應(yīng)新環(huán)境。由獸醫(yī)進行術(shù)前健康評估，根據(jù)疾病史、體格檢查、營養(yǎng)需要、行為類型及當?shù)匮驁霭l(fā)病情況進行診斷、檢測來評估每只羊的健康狀況。小尾寒羊合群性強，喜歡互相跟隨，離群的羊應(yīng)引起實驗人員重視，羊群快速行走時，尤其應(yīng)重點對落伍的羊進行全面的臨床系統(tǒng)檢查[6]。手術(shù)前應(yīng)對每一只羊進行全身各系統(tǒng)的健康檢查，結(jié)合臨床癥狀可進行血常規(guī)、血生化及心電圖的檢測。動物出現(xiàn)異常情況或發(fā)現(xiàn)疾病的臨床表現(xiàn)時應(yīng)立即隔離進行鑒別診斷，并給予治療，不可進行手術(shù)等相關(guān)實驗。通過有效的動物體格檢查及特殊檢查方法排除異常癥狀從而提高手術(shù)成功率。如發(fā)現(xiàn)重大傳染病，應(yīng)向有關(guān)部門上報，按照應(yīng)急預(yù)案操作程序進行處理。

1.4 術(shù)前飼養(yǎng)管理

小尾寒羊?qū)俜雌c動物，以草食為主，具有發(fā)達的采食和消化系統(tǒng)。有瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃及皺胃4個胃，前3個胃的黏膜無腺體組織，合稱前胃，皺胃黏膜內(nèi)分布有消化腺，所以稱真胃。其中瘤胃不能完全排空，在麻醉時極易發(fā)生瘤胃脹氣引起胃內(nèi)容物返流和吸入性肺炎，在麻醉中為常見的麻醉并發(fā)癥，在麻醉前應(yīng)作適當?shù)念A(yù)防措施減少出現(xiàn)此類并發(fā)癥[7]。術(shù)前48 h觀察小尾寒羊的腹部臌脹情況，如腹部臌脹明顯，為前幾日進食較多，術(shù)前禁食48 h。腹部臌脹不明顯，術(shù)前禁食24 h，禁水12 h。

1.5 術(shù)前準備

在實驗前對動物進行全面體檢后，做好術(shù)前實驗記錄，記錄包括：動物編號、體重、年齡、性別、血壓、心率、體溫及血氧飽和度等監(jiān)測參數(shù)，觀察動物的行為以確保動物健康。術(shù)前準確稱取動物體重，不僅可準確計算麻醉及治療用藥劑量，而且便于對比術(shù)后體重，評估觀察動物術(shù)后的健康狀況。此外術(shù)前應(yīng)進行手術(shù)區(qū)域的備皮，剔除羊毛范圍應(yīng)比手術(shù)區(qū)域略大為宜，規(guī)范的術(shù)前備皮可以減少術(shù)后切口感染幾率。

2 術(shù)中管理

2.1 麻醉誘導(dǎo)

麻醉前皮下注射阿托品0.05 mg/kg～0.1 mg/kg減少氣管和唾液腺分泌，降低氣道阻塞的危險。靜脈注射丙泊酚4 mg/kg～8 mg/kg進行誘導(dǎo)麻醉。動物用藥后表現(xiàn)出呼吸和心率加快，眼瞼反射存在，1 min～3 min后肌肉緊張度下降、眼瞼反射消失、呼吸和心率平穩(wěn)，可進行氣管插管。進入麻醉狀態(tài)后眼保護性反射消失，使用眼藥膏減少角膜干燥和損傷的危險。

2.2 氣管插管

小尾寒羊的開口度有限，腭間空間狹小，會厭部遠離口唇，行氣管插管較其他動物困難程度更高。待麻醉平穩(wěn)后，立即進行氣管插管。動物采取仰臥位保定、頸部伸直的狀態(tài)下，由助手放置開口器撐開口腔，用舌鉗將羊舌頭拉出。麻醉師左手持專用喉鏡，壓迫舌面，并向前推進，在喉鏡燈光引導(dǎo)下暴露會厭部，用喉鏡挑起會厭軟骨，暴露聲門，右手持改良含導(dǎo)絲的8.5號氣管插管，待動物呼吸聲門打開時，迅速插入氣管，深度約20 cm左右。抽出導(dǎo)絲，助手擠壓動物胸部，可以聞及氣管插管內(nèi)急速氣流聲音。靜置片刻，動物呼氣時可見氣管插管內(nèi)壁有呼吸道水蒸氣冷凝附壁現(xiàn)象。插管成功后，向氣囊內(nèi)注射約10 mL空氣，使氣囊處于膨脹且有彈性的狀態(tài)，將氣管插管固定在特制口腔固定器內(nèi)。

2.3 動物保定

保定方法需根據(jù)手術(shù)操作而定，后路手術(shù)需要折疊手術(shù)臺為“V”字型，并在頸部下方放置支撐三角形頸托。前路手術(shù)需要動物仰臥，頸部放置平板型頸托。保定時應(yīng)采用較寬且柔軟的綁帶捆綁四肢，綁帶固定部位過緊或手術(shù)時間較長，容易導(dǎo)致組織損傷和肢體末端水腫，加重動物術(shù)后痛苦。動物保定方法達到手術(shù)要求后，開啟手術(shù)臺恒溫加熱功能，保持適宜體溫，減少熱量丟失。

2.4 開通靜脈通路

手術(shù)中經(jīng)常需要打開深部組織，造成體液水分丟失，需術(shù)前開放靜脈通路。開通靜脈通路不僅能維持動物術(shù)中的循環(huán)體液穩(wěn)定而且便于術(shù)中治療藥物的靜脈注射。頸部靜脈穿刺開通靜脈通路，在保定時穿刺針容易脫出，且影響頸部手術(shù)操作。小尾寒羊耳部靜脈表淺、明顯，是進行表淺靜脈穿刺的良好選擇。耳部靜脈穿刺置靜脈留置針成功后，應(yīng)用適宜的紗布卷貼附固定留置針，能夠保持穿刺針穩(wěn)定固定在靜脈內(nèi)。隨后將留置針連接輸液器及生理鹽水，進行靜脈滴注。

2.5 吸入麻醉

同注射麻醉劑相比，大多數(shù)吸入麻醉劑都可迅速地被吸收和排除，因此吸入麻醉更容易被控制[8]。使用異氟烷進行吸入麻醉，動物麻醉平穩(wěn)后行氣管插管，接吸入麻醉機進行異氟烷吸入麻醉。使用緊閉回路的呼吸管路為22 mm雙支回路，5 L的呼吸氣囊，氧流量控制在1 L/min～3 L/min，麻醉師根據(jù)動物生命體征監(jiān)測指標狀況及手術(shù)操作需要調(diào)整麻醉氣體的濃度(2%～5%)，在手術(shù)過程中使動物保持麻醉平穩(wěn)狀態(tài)。

2.6 術(shù)中生命體征監(jiān)測

在小尾寒羊的脊柱外科手術(shù)過程中，通過對麻醉動物生命體征的監(jiān)測來評估動物個體，便于發(fā)現(xiàn)問題及時采取有效的處理措施，從而減少麻醉意外的發(fā)生。麻醉藥物均有危險性，保證麻醉安全的重要措施是有效細致的監(jiān)護。首先采取生理性監(jiān)護方法，對動物進行聽診心率、觸診脈搏、觀察可視黏膜顏色等生命體征進行臨床觀察。其次結(jié)合機械性監(jiān)護方法，借助監(jiān)護儀器設(shè)備監(jiān)測血氧飽和度、心電圖、血壓、心率、呼吸頻率及體溫等指標[9]。不同監(jiān)測方法重疊監(jiān)護能夠提供更多有益信息，發(fā)現(xiàn)監(jiān)測指標的差異性，以便確定是否存在麻醉風險。麻醉綿羊的正常生命體征為：心率80次/min～150次/min，呼吸頻率20次/min～40次/min，體溫為38.6℃～40℃，收縮動脈壓10.7 kPa～16 kPa，平均動脈壓10 kPa～14.7 kPa，舒張動脈壓8 kPa～10.7 kPa，動脈二氧化碳分壓3.7 kPa～4.8 kPa，動脈氧分壓9.6 kPa～12 kPa[6]。參考正常生命體征參數(shù)監(jiān)測術(shù)中麻醉的動物是十分必要的，麻醉藥的過量使用會導(dǎo)致心力衰竭，如紫紺、血壓下降、心率變化、甚至心臟停搏。麻醉藥使用不足，會導(dǎo)致動物在手術(shù)中蘇醒，造成動物的明顯痛感，有悖于實驗動物的倫理原則。血氧飽和度監(jiān)測比觀察氣管插管的呼吸次數(shù)，能更早期發(fā)現(xiàn)呼吸相關(guān)問題并及時的予以處理。小尾寒羊監(jiān)測舌部的血氧飽和度時，應(yīng)在舌部外面覆蓋濕潤鹽水紗布，避免舌部干燥。如果血氧飽和度過低，首先應(yīng)檢查氣管插管是否被異物堵住，防止小尾寒羊窒息死亡。術(shù)中小尾寒羊血氧飽和度降低常為氣管插管不通暢，或者插管脫出所致。而氣管插管不通暢的常見原因是喉部分泌物過多，應(yīng)適量增加阿托品的用量，并及時用負壓吸引器吸出分泌物。插管脫出應(yīng)暫停手術(shù)，及時再次實施氣管插管置入術(shù)。通過血氧飽和度、心電圖、血壓、心率、呼吸頻率、呼氣末二氧化碳及血氣分析等監(jiān)測手段，綜合評估動物在麻醉手術(shù)中的整體情況可以及時發(fā)現(xiàn)異常生理情況，采取有效相應(yīng)的措施進行監(jiān)護和治療，保證在整個手術(shù)過程中動物保持麻醉平穩(wěn)狀態(tài)，避免出現(xiàn)麻醉并發(fā)癥造成麻醉意外。

2.7 手術(shù)操作注意要點

小尾寒羊頸前路手術(shù)入路中存在多個重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)時注意對頸動脈、頸靜脈和椎動脈的保護。這些血管均為主要枝干，損傷后可導(dǎo)致大出血，處理困難，導(dǎo)致實驗動物的死亡。避免過度牽拉食管和氣管，食管和氣管損傷后當時無明顯異常，但術(shù)后卻可引起縱膈感染，病死率較高。術(shù)中、術(shù)后充分止血，因頸部前方結(jié)構(gòu)多體積小，易形成血腫壓迫氣管，嚴重時可造成實驗動物的死亡。在頸后路手術(shù)入路中小尾寒羊與人類頸部解剖結(jié)構(gòu)最大不同點在于項韌帶、椎板寬度、椎板厚度、椎板硬度和椎管大小。小尾寒羊的項韌帶比人類發(fā)達，對頸部運動影響極大，應(yīng)盡量減少對其的損傷。小尾寒羊的椎板比人類傾斜角度大，且寬度小，可操作空間小，更需要實驗人員充分了解其解剖特點，仔細設(shè)計手術(shù)方式，減少非必須的骨質(zhì)破壞。小尾寒羊椎板厚度大于人類，不可依據(jù)常規(guī)臨床手術(shù)經(jīng)驗，而是應(yīng)在直視狀態(tài)下，用高速磨鉆逐次、細致的磨開椎板。一般來說，對小尾寒羊?qū)嵤┳蛋迨中g(shù)的時間要明顯多于臨床上的椎板手術(shù)時間。此外小尾寒羊的椎管內(nèi)徑較人類小，所以手術(shù)中，如果需要暴露椎管，一定要十分小心，非常容易損傷脊髓，造成術(shù)后動物活動障礙，甚至截癱。縫合皮膚時，進行外翻縫合。因羊毛生長速度快，如手術(shù)切口內(nèi)存在毛囊，術(shù)后短期羊毛生長出來后，可以造成局部的炎癥反應(yīng)，甚至延緩手術(shù)切口的愈合。

3 術(shù)后管理

3.1 麻醉蘇醒期處理

術(shù)后麻醉蘇醒期動物需要溫暖、安靜、光照柔和的蘇醒環(huán)境，室內(nèi)溫度維持在21℃～24℃。動物避免口鼻和眼睛上粘附木屑、刨花及玉米芯等墊料，手術(shù)傷口遠離動物糞尿污染的墊料。多數(shù)異氟烷吸入麻醉的小尾寒羊在術(shù)后完全蘇醒能夠站立行走后放入蘇醒室。如未能及時蘇醒站立行走，選取向一側(cè)體位擺放動物體位，伸展頭頸，將部分舌拉出口腔外，減少呼吸道堵塞的風險。術(shù)后護理應(yīng)由專業(yè)技術(shù)人員進行觀察，及時了解動物狀態(tài)采取相應(yīng)的治療和處理措施。雖然無菌技術(shù)能夠減少術(shù)后抗生素的使用，但是無法避免糞尿及飼養(yǎng)環(huán)境污染傷口，術(shù)后預(yù)防性使用抗生素可減少傷口感染的發(fā)生。

3.2 術(shù)后飼養(yǎng)管理

術(shù)后觀察小尾寒羊的飲食、活動情況，觀察其精神狀態(tài)和對刺激的反應(yīng)，記錄其攝食量、飲水量、糞便和尿液的排出量，并重點觀察手術(shù)切口的情況。術(shù)后應(yīng)注意飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生清潔，保持環(huán)境條件的穩(wěn)定，減少術(shù)后感染的發(fā)生，飼喂易消化的飼料和清潔飲水。必要時進行術(shù)前與術(shù)后體重比較，結(jié)合生命體征監(jiān)測進行靜脈補充9 g/L生理鹽水或50 g/L葡萄糖液，動物手術(shù)后1周內(nèi)使用止痛藥作為常規(guī)治療，減少動物的應(yīng)激、痛苦和傷害。

4 討論

小尾寒羊適應(yīng)性好，生長發(fā)育快，肉毛兼用，在我國分布較廣，是我國優(yōu)良綿羊品種之一[10]。在椎體、椎管、椎弓根、椎骨密度等方面與人類頸椎的變化趨勢有很多相似性[11]，成為研究頸椎病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要實驗用動物。雖然在比較醫(yī)學研究中小尾寒羊尚屬于試驗用動物并非標準實驗動物，但是因其特有的生物學特性及解剖特點成為科研人員建立外科實驗動物模型的理想選擇。

小尾寒羊脊柱手術(shù)圍手術(shù)期的管理需嚴格按動物倫理審批項目的規(guī)定執(zhí)行實驗方案，充分考慮動物的利益，善待動物，減少動物的應(yīng)激、痛苦和傷害，尊重動物生命，采取痛苦最少的方法處置動物從而保證動物福利。只有制定合理的隔離檢疫制度，及時檢測人畜共患疾病，才能篩選出符合實驗要求的小尾寒羊為動物實驗提供安全保障。在麻醉過程中根據(jù)實驗需要充分做好麻醉前的準備工作，采用丙泊酚靜脈注射誘導(dǎo)麻醉、進行經(jīng)口氣管插管、開放靜脈通路、異氟烷吸入麻醉、生理性結(jié)合機械性生命體征監(jiān)測等改良新技術(shù)方法，有效保證了多例小尾寒羊脊柱外科手術(shù)的順利完成。相比以往肌肉注射速眠新等麻醉藥物進行全身麻醉小尾寒羊的方法，明顯提高了動物手術(shù)成功率，減少了麻醉并發(fā)癥造成的麻醉意外，對于實驗用羊外科手術(shù)的麻醉是一種安全、有效、易操作、值得推廣的麻醉方法。

小尾寒羊脊柱外科手術(shù)圍手術(shù)期管理中尤其應(yīng)注意如下要點：①手術(shù)體位放置：前路頸椎手術(shù)時動物保定體位為仰臥位，而對于后路脊柱手術(shù)，動物術(shù)中處于俯臥位。體位放置前需要詳細的考慮和周密計劃以及正確的配合和充分的人手。進行脊柱手術(shù)保定及搬運動物過程中，動物頭部大多數(shù)被牽引，禁忌扭轉(zhuǎn)、過曲或過伸。及時固定頭頸部，盡量減少頭頸的活動次數(shù)和幅度，保持頸椎的穩(wěn)定性，避免頸深部血腫的形成，保持呼吸道通暢[12]。特別是在動物使用麻醉藥及肌松藥后危險性更高，有相關(guān)報道出現(xiàn)了新的神經(jīng)功能缺失癥狀[13]。②呼吸道管理：由于頸前路手術(shù)中對氣管和食管的牽拉刺激，術(shù)后動物呼吸道分泌物常增多，易形成痰液堆積。實驗動物的手術(shù)切口疼痛無力將痰咳出。術(shù)前行氣管插管能夠有效保證呼吸道通暢，術(shù)后給予地塞米松及沐舒坦等藥物對癥治療，可減輕呼吸道炎癥、水腫，稀釋痰液，使其易于排出[14]。③手術(shù)并發(fā)癥觀察與護理：手術(shù)器械對脊髓的直接壓迫，手術(shù)環(huán)鉆的震動，切除脊髓的骨片時骨片對脊髓的沖擊及硬膜外血腫直接壓迫脊髓等均可造成神經(jīng)根損害、脊髓損傷加重。麻醉清醒后應(yīng)進行觀察頸椎活動范圍、注意前肢與后肢兩側(cè)活動是否對稱、肢體自主活動程度、軀體運動障礙、排糞排尿功能障礙甚至癱瘓等現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)異常及時采取必要的治療措施，以減少后遺癥發(fā)生[15-16]。

根據(jù)實驗用羊的生物學特性在圍手術(shù)期間應(yīng)重點注意手術(shù)過程中瘤胃臌氣、胃內(nèi)容物返流、吸入性肺炎、通氣不足等并發(fā)癥的發(fā)生，合理的麻醉方法和充分的麻醉前準備工作可以避免這些并發(fā)癥的發(fā)生幾率。術(shù)前手術(shù)區(qū)域的規(guī)范應(yīng)仔細備皮、消毒、鋪巾，穿戴手術(shù)衣、口罩、手術(shù)帽，預(yù)防性給予抗生素均可以減少動物的感染幾率，促進切口恢復(fù)。術(shù)中麻醉師和術(shù)者積極配合，通過血壓、心率和血氧等指標監(jiān)測動物循環(huán)和呼吸功能，即可保證最少的麻醉藥劑量，保證術(shù)后動物盡早蘇醒。雖然現(xiàn)在有多種廣譜抗生素，但無菌操作仍然需要嚴格遵守。實驗動物的麻醉、外科手術(shù)等實驗后機體容易受到較大的損傷，發(fā)生異常病理、生理反應(yīng)，此時易遭到微生物、寄生蟲侵襲，從而影響實驗結(jié)果的科學性和準確性。因此在動物實驗的圍手術(shù)期間應(yīng)嚴格控制影響動物實驗因素，規(guī)范管理圍手術(shù)期的各環(huán)節(jié)，適時采取相應(yīng)措施保證實驗動物完全康復(fù)，達到預(yù)期實驗?zāi)康摹?/p>

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