MicroRNA的生物學(xué)功能及其與腫瘤診斷和治療的研究進(jìn)展

王明陽(yáng)，王光磊，陳新亮，張 燚，龍 淼

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866)

1993年Lee在研究線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)調(diào)控發(fā)育的基因lin-4，隨后又在線(xiàn)蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)分子let-7，從此打開(kāi)了人們對(duì)于miRNA的研究大門(mén)[1]。在之后的研究中人們認(rèn)識(shí)到miRNA是一種高度保守的小分子。miRNA在生物體內(nèi)不參與蛋白質(zhì)的合成，但是在編碼蛋白的基因表達(dá)方面有著非常重要的調(diào)控作用。miRNA在細(xì)胞核中在DNA聚合酶2作用下由編碼的miRNA基因轉(zhuǎn)錄成miRNA的前體pre-miRNA，再由細(xì)胞核內(nèi)的RNase3-Drosha酶經(jīng)加工剪切為70個(gè)核苷酸，類(lèi)似發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。pre-miRNA在核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin5的作用下，從細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中在RNase3-Dicer酶的作用下，pre-miRNA被剪成雙鏈的miRNA，成熟的miRNA與其互補(bǔ)的序列結(jié)合成雙螺旋結(jié)構(gòu)，隨后雙螺旋解旋，其中一條與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC結(jié)合，識(shí)別靶mRNA并阻止其翻譯[2]。

1 miRNA的生物學(xué)功能

miRNA作為一種特殊的遺傳物質(zhì)，成為當(dāng)今學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。對(duì)miRNA的研究正在不斷增加，原因是科學(xué)家認(rèn)識(shí)到這些普遍存在的小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。在線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅、小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個(gè)miRNA中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達(dá)模式具有分化的位相性和時(shí)序性，提示miRNA有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。

1.1 哺乳動(dòng)物中的miRNA通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因來(lái)影響mRNA對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯

用核糖體分析來(lái)測(cè)量miRNA對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的總體影響，并將其與同時(shí)測(cè)量的mRNA水平的影響進(jìn)行比較。 對(duì)于異位和內(nèi)源性miRNA調(diào)節(jié)相互作用，蛋白質(zhì)生產(chǎn)減少的84%是由于mRNA的降低引起的[3]。 表明mRNA水平的變化反映了miRNA對(duì)基因表達(dá)的影響，并表明目標(biāo)mRNA的不穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)含量降低的主要原因。這反映了哺乳動(dòng)物miRNA主要用于降低靶mRNA水平，使miRNA對(duì)蛋白的翻譯產(chǎn)生了影響。

1.2 miRNA對(duì)肌肉發(fā)育的調(diào)節(jié)作用

Wang Y H等[4]對(duì)山羊骨骼肌的兩個(gè)發(fā)育階段(胎兒階段和6月齡階段)miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了綜合研究，從胎山羊文庫(kù)(FC)和6月齡山羊文庫(kù)(SMC)分別獲得了15 627 457和15 593 721個(gè)miRNA，鑒定了464種已知miRNA和83種新型miRNA候選物，通過(guò)比較miRNA譜，鑒定出336個(gè)差異表達(dá)的miRNA，然后預(yù)測(cè)差異表達(dá)的miRNA的潛在靶標(biāo)。為了了解肌肉發(fā)育過(guò)程中miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)兩個(gè)發(fā)育階段的mRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析，確定了7 322個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)。然后將miRNA的潛在靶標(biāo)與DEGs進(jìn)行比較，篩選出2個(gè)基因組的交叉點(diǎn)，稱(chēng)為差異表達(dá)靶標(biāo)(DE-靶標(biāo))，其涉及231個(gè)途徑。具有最小P值的231個(gè)途徑中的10個(gè)顯示為網(wǎng)絡(luò)通路。基于通路和網(wǎng)絡(luò)的分析，研究發(fā)現(xiàn)miR-424-5p和miR-29a可能對(duì)肌肉發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，需要進(jìn)一步研究。這項(xiàng)研究闡明miRNA和mRNA之間的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及miRNA對(duì)肌肉發(fā)育的作用。

2 miRNA靶基因的確定

盡管數(shù)百種miRNA在最近幾年中被發(fā)現(xiàn)，但是只有非常少量的miRNA被確定其作用，許多其他miRNA的作用還沒(méi)有被闡明。因此,發(fā)現(xiàn)miRNA的作用靶點(diǎn)成為了解其在不同的生理過(guò)程中的功能的關(guān)鍵。

2.1 基因芯片法

將miRNA成熟體雙鏈或腺病毒載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使得miRNA在細(xì)胞中表達(dá)提高，之后利用基因芯片分析mRNA的變化，以找出相應(yīng)miRNA的靶基因。由于miRNA在體內(nèi)通過(guò)翻譯抑制或影響mRNA的穩(wěn)定性起作用，因此這種方法在尋找翻譯抑制作用的miRNA的靶基因時(shí)存在一定困難。

2.2免疫共沉淀法

利用AGO蛋白家族既能結(jié)合miRNA又能結(jié)合mRNA的特性，分別使用AGO-1和AGO-2蛋白的單克隆抗體在人類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀，得到與AGO-1和AGO-2蛋白結(jié)合的mRNA條帶，并通過(guò)克隆測(cè)序?qū)@些mRNA進(jìn)行鑒定。同時(shí)從與AGO-1蛋白結(jié)合的mRNA中隨機(jī)挑選幾條進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),鑒定哪條是miRNA的靶基因[5]。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)是指在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析的一種新技術(shù)。它不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，還可以通過(guò)質(zhì)譜圖上輕重穩(wěn)定同位素峰的比例來(lái)反映對(duì)應(yīng)蛋白在不同狀態(tài)下的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的精確定量[6]。

2.4 miRNA靶基因的鑒定

目前最為常用的miRNA靶位點(diǎn)鑒定方法是熒光素酶報(bào)告基因法[7]。其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體，將希望鑒定的miRNA靶基因的3′UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3′UTR中，之后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平，最后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染3′UTR中是否含有miRNA的靶位點(diǎn)。該方法因?yàn)槭菍?duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，因而檢測(cè)的準(zhǔn)確率較高。

3 miRNA在腫瘤方面的應(yīng)用

miRNA在生物的生命過(guò)程和疾病發(fā)生過(guò)程中扮演著十分重要的角色[8]。其中尤其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系十分密切。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中miRNA常作為腫瘤臨床診斷的標(biāo)志物[9]。而越來(lái)越多的研究表明，miRNA作為原癌基因和抑癌基因也為臨床癌癥的診療提供了一個(gè)新思路。

3.1 miRNA在腫瘤診斷方面的應(yīng)用

傳統(tǒng)的惡性腫瘤確診方法是通過(guò)外科手術(shù)方法在腫瘤處取樣做石蠟切片，這種診斷方式十分繁瑣。目前有研究表明，癌癥患者體內(nèi)miRNA表達(dá)差異顯著。miRNA有希望成為癌癥治療中的新靶標(biāo)和工具。有報(bào)道指出，在胃癌細(xì)胞系MKN-45的SP細(xì)胞內(nèi)有關(guān)鍵miRNA，包括hsa-miR-3175、hsa-miR-203、hsa-miR-130a、hsa-miR-324-5p、hsa-miR -34a和hsa-miR-25-star。這些關(guān)鍵的miRNA可通過(guò)進(jìn)一步研究作為胃癌診斷的標(biāo)志物[10]。研究認(rèn)為，通過(guò)分析黑色素瘤患者的血清的754個(gè)miRNA,結(jié)果表明miR-146a在UM患者血清以及血清外顯子中均有上調(diào)。在福爾馬林固定的石蠟包埋的UM中也檢測(cè)到miR-21和miR-146a的上調(diào)，因此miR-146a可以被認(rèn)為是UM的潛在循環(huán)標(biāo)志物[11]。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在29例良性前列腺增生(BPH)患者和215例前列腺癌患者的無(wú)細(xì)胞尿液樣品中92種miRNA的表達(dá)水平的分析，發(fā)現(xiàn)了2組新的miRNA生物標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)是否可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)前列腺癌的存在和前列腺切除術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性，需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。但這一發(fā)現(xiàn)為前列腺癌的臨床診斷提供了新思路[12]。逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)了40個(gè)對(duì)照受試者，187個(gè)早期乳腺癌患者和45個(gè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的miRNA水平，發(fā)現(xiàn)miR-1280，miR-1260和miR-720在乳腺癌患者血液中上調(diào)，miR-1280水平在乳腺癌患者中顯著增加。在37例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，miR-1280水平顯著降低。所以,miR-1280不是原始的miRNA，而是tRNA Leu衍生的片段。表明循環(huán)的tRNA衍生的miRNA，miR-1280在乳腺癌患者中的不同表達(dá)，可能作為ER陽(yáng)性乳腺癌的生物標(biāo)志物[13]。這也為乳腺癌的診斷提供了新思路。

3.2 miRNA在腫瘤治療方面的應(yīng)用

當(dāng)代醫(yī)學(xué)對(duì)腫瘤的治療通常采用外科手術(shù)切除癌變的組織或器官，之后采取放療、化療的方法殺死癌細(xì)胞防止擴(kuò)散。外科手術(shù)可以清除病變的組織和器官，但無(wú)法完全清除體內(nèi)的癌細(xì)胞，所以需要后續(xù)的放療和化療。但放療和化療不僅殺死癌細(xì)胞，也破壞了健康的組織和器官，所以尋找一種安全有效的可代替放療、化療的方法變得十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，miR-503在晚期前列腺癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，miR-503的下調(diào)與侵襲性臨床病理特征和前列腺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)。表明miR-503在前列腺癌治療中的潛在應(yīng)用[14]。miR-134-3p的表達(dá)在人卵巢癌干細(xì)胞(OCSCs)和CD44- / CD133-卵巢癌中顯著變化。miR-134-3p在人類(lèi)OCSCs中的過(guò)表達(dá)不僅可以抑制RAB27A的表達(dá)，而且可以有效地下調(diào)一些腫瘤增殖和侵襲基因的表達(dá)。 miR-134-3p的過(guò)度表達(dá)不僅可以抑制人類(lèi)OCSCs的體外增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，而且可以降低裸鼠的致瘤性[15]。在肝癌患者血清和肝癌細(xì)胞系中觀察到miR-200a的表達(dá)水平降低，miR-200a在肝癌細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)降低了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。轉(zhuǎn)錄因子Foxa被鑒定為miR-200a的新靶標(biāo)，并在miR-200a過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)水平下調(diào)。同時(shí)，F(xiàn)oxa2的恢復(fù)顯著抑制了miR-200a的腫瘤抑制作用。這表明miR-200a通過(guò)靶向Foxa2調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明miR-200a可能作為肝癌診斷和治療的潛在分子[16]。 miR-520e通過(guò)直接靶向Zbtb7a的3'非翻譯區(qū)(UTR)并因此降低Zbtb7a蛋白水平，顯著調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移。 miR-520e對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的這些影響可以通過(guò)Zbtb7a在A549細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)來(lái)說(shuō)明。 此外，miR-520e水平和Zbtb7a水平均與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。 這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)的miR-520e調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移是通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Zbtb7a在Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)來(lái)產(chǎn)生作用的，說(shuō)明miRNA-520e通過(guò)靶向Zbtb7a介導(dǎo)的Wnt信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)70例HCC和相應(yīng)腫瘤相鄰組織中miR-577的相對(duì)表達(dá)，用卡方檢驗(yàn)分析miR-577表達(dá)及臨床特征。將miR-577質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，通過(guò)MTT法和BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)和caspase3/7活性分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡。通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定β-catenin的表達(dá)。 Spearman相關(guān)分析用于分析miR-577和β-catenin之間的關(guān)系。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常腫瘤相鄰組織相比，肝癌組織中miR-577的相對(duì)表達(dá)顯著降低。 miR-577的低表達(dá)與腫瘤大小和晚期腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段顯著相關(guān)。 miR-577質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染可抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，阻斷G0/G1期細(xì)胞周期。 HCC組miR-577與β-catenin的下游靶標(biāo)表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。說(shuō)明miR-577的低表達(dá)與HCC組織惡性臨床病理特征有關(guān)，miR-577可通過(guò)下調(diào)β-catenin抑制HCC的生長(zhǎng)[18]。研究發(fā)現(xiàn)miR-146a與相應(yīng)的正常組織相比，在宮頸癌(CaCx)中表現(xiàn)出高表達(dá)，但結(jié)直腸癌(CRC)表達(dá)相對(duì)較低。然而，miR-146a的異位表達(dá)抑制宮頸癌(CaCx)和結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞的增殖，并抑制其遷移和侵襲。當(dāng)內(nèi)源性miR-146a的表達(dá)被抑制時(shí)，宮頸癌(CaCx)和結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力增加，表明miR-146a具有抗腫瘤發(fā)生功能。 miR-146a的重新表達(dá)下調(diào)關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中間體的表達(dá)，即CTNNB1、STAT3、RELA、CCND1和SNAI1，增強(qiáng)TP53和CDH1表達(dá)。這說(shuō)明miR-146a為人宮頸癌和大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制提供了依據(jù)[19]。這些都表明miRNA可能成為癌癥治療的新方法。

3.3 miRNA在腫瘤預(yù)后方面的應(yīng)用

腫瘤的預(yù)后是當(dāng)今醫(yī)學(xué)的一大難題，但是大量研究表明癌癥的發(fā)生與體內(nèi)miRNA的表達(dá)水平有著十分密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)miR-148靶向的39個(gè)非翻譯區(qū)中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可以改變其結(jié)合強(qiáng)度，影響癌癥的易感性和預(yù)后[20]。miR-22和TIAM1可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，低miR-22水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)[21]。miR-330-5p可用于食管癌腺癌新輔助放化療敏感性的調(diào)節(jié)[22]，miR-33a抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，可能是非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后指標(biāo)[23]，表明miRNA可作為癌癥預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志。

4 結(jié)語(yǔ)

研究發(fā)現(xiàn)的大量miRNA在細(xì)胞的早期發(fā)育、分化、更新、基因的調(diào)節(jié)和表達(dá)、以及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都有十分密切的關(guān)系，但許多miRNA與靶基因的作用機(jī)理，以及miRNA對(duì)下游靶基因的識(shí)別和鑒定都沒(méi)有詳細(xì)的闡述。而miRNA在病理中的作用，尤其是miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的詳細(xì)的機(jī)理沒(méi)有明確的闡述，這些將成為今后研究的重點(diǎn)。相信隨著對(duì)于miRNA研究的深入，miRNA將會(huì)越來(lái)越多的應(yīng)用于基因的調(diào)控與表達(dá)，病理機(jī)理的闡述，藥物作用的分析，人們對(duì)于miRNA的應(yīng)用也會(huì)越來(lái)越廣泛。

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