高危型HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的篩查價(jià)值*

侯書寧，程文國，陸紅梅，李瑩瑩，沈倩云，曹 月

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院揚(yáng)州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，江蘇揚(yáng)州 225002

宮頸癌是指發(fā)生于宮頸鱗-柱狀上皮移行帶的女性惡性腫瘤。2018年WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：宮頸癌是全球女性第4大癌癥，發(fā)生率為13.1/10萬，2018年全球大約有57萬例宮頸癌患者，死亡病例約31.1萬例[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)是女性常見生殖道感染病原體，為一種黏膜微小共價(jià)雙鏈環(huán)狀DNA病毒，呈球形、無包膜，表面有72個(gè)殼微粒，主要由早期基因區(qū)(E區(qū))、晚期基因區(qū)(L區(qū))和長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)組成。HPV主要感染皮膚和黏膜組織的上皮細(xì)胞，與生殖器疣變、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)，明顯的持續(xù)性感染可表現(xiàn)為單一型別感染、多型別感染。HPV檢測(cè)雖能檢測(cè)出是否有高危型HPV(HR-HPV)感染，但不能區(qū)分是短暫感染還是持續(xù)性感染。研究表明，HPV E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是宮頸組織HPV持續(xù)感染和惡變所必需的，可作為反映宮頸病變進(jìn)展的臨床標(biāo)志物[2-3]。本研究通過比較分析HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)患者中的檢測(cè)結(jié)果，探討其在HSIL篩查中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選擇2020年6月至2021年7月在揚(yáng)州市婦幼保健院因?qū)m頸炎癥、接觸性出血等原因就診的疑似宮頸病變而轉(zhuǎn)陰道鏡活檢的639例患者作為研究對(duì)象，年齡16～73歲，平均(38.8±10.1)歲。按照年齡將患者分為≤25歲組、>25～35歲組、>35～45歲組、>45～55組、>55歲組。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均行HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)、液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)和宮頸活體組織檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往患有宮頸癌前病變患者；近期有激素使用史的患者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 在非月經(jīng)期，統(tǒng)一由培訓(xùn)合格的醫(yī)師采用宮頸刷采集研究對(duì)象宮頸脫落細(xì)胞，方法：取膀胱截石位，充分暴露宮頸，抹去分泌物，取樣器置于宮頸鱗柱狀交界處同一方向旋轉(zhuǎn)3～5圈，并停留6～8 s后連同刷子一起浸泡于2 mL保存液中送檢。

1.2.2TCT 采用三瑞集團(tuán)液基薄層細(xì)胞制片機(jī)進(jìn)行程序化處理，制成直徑約為2 cm的細(xì)胞涂片，使用95%乙醇固定，進(jìn)行巴氏染色，然后鏡檢。宮頸細(xì)胞病理學(xué)診斷按照國際癌癥學(xué)會(huì)推薦的2001年Bethesda體系(TBS)分級(jí)：(1)未見CIN或惡性病變(NILM)；(2)不能明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)和不能明確意義的非典型腺上皮細(xì)胞(AGUS)；(3)低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)；(4)HSIL；(5)鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和腺癌(AC)。細(xì)胞學(xué)陽性診斷是指ASCUS/AGUS及以上的病變。

1.2.3HR-HPV DNA分型(PCR-導(dǎo)流雜交法) 采用潮州凱普生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)的37種HPV核酸檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)試劑與對(duì)照系統(tǒng)靈敏度為99.5%，特異度為97.7%，可信區(qū)間下限均高于96%。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過基因擴(kuò)增技術(shù)和導(dǎo)流雜交技術(shù)，以核酸分子快速雜交儀為平臺(tái)通過反向雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與包被有型特異性探針膜雜交結(jié)果，對(duì)37種HPV基因型進(jìn)行分型檢測(cè)，其中包括14種HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟包括：HPV DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交、洗膜、顯色和結(jié)果判斷。檢測(cè)結(jié)果陽性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，根據(jù)膜條上各型HPV探針排列，判斷陽性點(diǎn)為何種HPV類型。判斷標(biāo)準(zhǔn)：任何一種HR-HPV 亞型陽性即為陽性。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 采用分支鏈DNA信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)標(biāo)本中的14種HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)E6/E7 mRNA進(jìn)行半定量檢測(cè)，試劑盒購自河南科蒂亞生物有限公司，檢測(cè)結(jié)果=RLU/cut-off(其中RLU為冷光儀讀數(shù)，cut-off=空白對(duì)照均值與空白對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)差的3倍之和)，檢測(cè)結(jié)果值≥1.0為陽性。

1.2.5組織病理學(xué)檢查 活檢標(biāo)本常規(guī)制成石蠟切片，HE染色，由病理科醫(yī)師閱片并做出病理診斷，以該診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。組織病理學(xué)診斷：(1)慢性宮頸炎；(2)LSIL，包括CIN1；(3)HSIL，包括CIN2，CIN3和宮頸癌。

2 結(jié) 果

2.1HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果比較 對(duì)639例疑似宮頸病變患者分別進(jìn)行HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，HR-HPV DNA總陽性率為81.06%(518/639)，明顯高于HPV E6/E7 mRNA的52.58%(336/639)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=116.910，P<0.05)。

2.2不同年齡段患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果比較 不同年齡段患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；相同年齡段患者HR-HPV DNA陽性率均高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.05)。見表1。

表1 不同年齡段患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

2.3不同細(xì)胞病理學(xué)分級(jí)患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果比較 不同細(xì)胞病理學(xué)分級(jí)患者比較，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相同細(xì)胞病理學(xué)分級(jí)患者比較，NILM、ASCUS、LSIL患者的HR-HPV DNA陽性率均高于HPV E6/E7 mRNA陽性率(P<0.05)，而HSIL患者的HPV DNA陽性率與HPV E6/E7 mRNA陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同細(xì)胞病理學(xué)分級(jí)患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

2.4不同組織病理學(xué)分級(jí)患者HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果比較 不同組織病理學(xué)分級(jí)患者比較，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率均隨組織病理學(xué)分級(jí)增高而升高(P<0.05)；相同組織病理學(xué)分級(jí)患者比較，HR-HPV DNA陽性率均高于HPV E6/E7 mRNA陽性率(P<0.05)。見表3。

表3 不同組織病理學(xué)分級(jí)患者HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

2.5HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)篩查HSIL的價(jià)值 以組織病理學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，即HSIL為陽性，慢性炎癥及LSIL為陰性。HR-HPV DNA檢測(cè)篩查HSIL的靈敏度為97.14%，高于HPV E6/E7 mRNA的82.86%(χ2=3.968，P<0.05)；HR-HPV DNA檢測(cè)篩查HSIL的特異度為19.87%，低于HPV E6/E7 mRNA的49.17%(χ2=114.736，P<0.05)。見表4。

表4 HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA篩查HSIL的結(jié)果

2.6HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)篩查HSIL的價(jià)值 以HSIL篩查結(jié)果為狀態(tài)變量(HSIL=1，慢性炎癥及LSIL=0)，以HR-HPV DNA二分類結(jié)果及HPV E6/E7 mRNA半定量結(jié)果為檢驗(yàn)變量制作ROC曲線，結(jié)果顯示，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)篩查HSIL的曲線下面積(AUC)分別為0.587(95%CI：0.507～0.667)、0.755(95%CI：0.671～0.838)、0.770(95%CI：0.693～0.847)，二者聯(lián)合檢測(cè)及HPV E6/E7 mRNA單獨(dú)檢測(cè)篩查HSIL的AUC大于HR-HPV DNA單獨(dú)檢測(cè)的AUC(Z=5.102、3.964，P<0.05)。見圖1。

圖1 HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)篩查HSIL的ROC曲線

3 討 論

目前宮頸癌常用的篩查方法為HPV DNA檢測(cè)和TCT。TCT的受影響因素較多，通常與病理診斷醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)有關(guān)，容易漏檢。宮頸癌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)異常通常為晚期，限制了TCT對(duì)宮頸癌的早期診斷[4]。也有研究報(bào)道，TCT與傳統(tǒng)巴氏涂片法相比，其診斷HSIL的靈敏度和特異度均無明顯優(yōu)勢(shì)[5]。HPV檢測(cè)相對(duì)于細(xì)胞學(xué)檢查有較高的靈敏度和可重復(fù)性，是篩查宮頸癌和癌前病變的重要手段[6-7]。2010年歐洲生殖道感染和腫瘤研究組織(EUROGIN)推薦HPV DNA檢測(cè)可用于宮頸癌的初步篩查。國內(nèi)研究表明，采用二代雜交捕獲技術(shù)檢測(cè)HPV DNA可作為宮頸癌篩查的初步手段。HPV DNA檢測(cè)只能說明患者有無感染HPV，并不能說明病毒有無整合入宿主細(xì)胞而引發(fā)持續(xù)性感染。HR-HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致癌前病變和宮頸癌的重要致病因素[8-9]。HR-HPV感染后，DNA基因整合到宿主細(xì)胞染色體中，E6/E7表達(dá)的癌基因蛋白有抑制抑癌蛋白p53和Rb功能，影響感染細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，導(dǎo)致細(xì)胞向癌變方向發(fā)展[10-11]。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可反映HPV致癌基因E6/E7活動(dòng)度，判斷病毒基因是否整合到宿主基因組中以及區(qū)分HPV狀態(tài)，在早期宮頸癌篩查中具有重要意義。REN等[12]研究表明HPV E6/E7 mRNA定量分析是ASCUS分流的一種有價(jià)值的檢測(cè)方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞病理學(xué)級(jí)別升高，HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽性率也升高，且HR-HPV DNA總體陽性率明顯高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.05)，表明部分HPV感染未引起宿主細(xì)胞的病理性變化。在組織病理學(xué)檢查結(jié)果中HPV E6/E7 mRNA陽性率低于HR-HPV DNA陽性率(P<0.05)，這與BARON等[13]的研究結(jié)果一致，這可能是由于大多數(shù)HPV感染是一過性感染，病毒基因未整合到宿主基因中或者整合程度低，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)呈陰性，表示宮頸細(xì)胞無惡變轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)或者處于靜止期，但HPV DNA檢測(cè)仍可以檢測(cè)到HPV的存在。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可以降低一過性HPV感染出現(xiàn)的假陽性，提高病理診斷符合率。

本研究顯示，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)篩查HSIL的AUC大于HR-HPV DNA(P<0.05)，表明HPV E6/E7 mRNA較HR-HPV DNA篩查HSIL的效能更高，篩查宮頸癌前病變的效果更好。由于HPV E6/E7 mRNA只表達(dá)于感染活躍的細(xì)胞，且其負(fù)荷量與疾病進(jìn)展有關(guān)，故推測(cè)HPV E6/E7 mRNA對(duì)于HSIL的檢測(cè)更為特異，對(duì)宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展有很好的預(yù)測(cè)意義，是臨床診療中更高效、可靠的篩查方法。BRUNO等[14]研究表明，在3年的隨訪中，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽性的患者宮頸病變惡性發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)更高。

本研究可能存在一定局限性，需積累更多樣本進(jìn)一步驗(yàn)證HPV DNA和HPV E6/E7mRNA對(duì)HSIL的診斷效能；還應(yīng)避免因樣本容量不足，導(dǎo)致檢驗(yàn)效能降低，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，影響診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果的真實(shí)性。

目前我國針對(duì)宮頸癌遵循“三階梯”診斷程序進(jìn)行臨床診斷，即宮頸細(xì)胞病理學(xué)檢查和HR-HPV檢測(cè)、陰道鏡檢查及組織病理學(xué)檢查[15]，細(xì)胞病理學(xué)檢查陽性合并HR-HPV DNA陽性患者轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查及組織病理學(xué)診斷。因此，提高“三階梯”篩查模式中第一階段的靈敏度和特異度對(duì)提升整個(gè)宮頸癌早期篩查質(zhì)量至關(guān)重要。HPV E6/E7 mRNA的特異度相對(duì)較高，其與HR-HPV DNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HSIL具有較高的篩查價(jià)值，可降低因較高HR-HPV DNA陽性率的細(xì)胞學(xué)輕度異常患者的陰道鏡轉(zhuǎn)診率，為宮頸鱗狀上皮癌前病變的分流提供相關(guān)證據(jù)。

綜上所述，HR-HPV DNA檢測(cè)篩查HSIL的靈敏度比HPV E6/E7 mRNA高，但特異度較低，而HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)HSIL的臨床篩查價(jià)值高于HR-HPV DNA，可為宮頸癌前病變分流提供依據(jù)。