血清GFAP水平與NBNA評分在新生兒HIE中的臨床價值

尹緒鳳，陳少軍，李文斌

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院兒科，湖北十堰 442000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，湖北武漢 430030

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指在圍生期因各種因素導(dǎo)致窒息，進(jìn)而引起胎兒或新生兒缺氧缺血性腦損傷[1]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為新生兒HIE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常是多種機(jī)制相互作用導(dǎo)致的病理結(jié)果，主要包含因腦血流量降低、腦組織供氧不足繼而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、大腦興奮性氨基酸釋放、炎癥相關(guān)因子釋放、血腦屏障破壞等[2-3]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國HIE的發(fā)病率為3‰～6‰，15%～20%的HIE患兒在新生兒期發(fā)生死亡，25%～30%的HIE患兒則出現(xiàn)嚴(yán)重、永久、不可逆性的神經(jīng)功能障礙[4]。

HIE患兒的臨床癥狀是其主要診斷依據(jù)，對其進(jìn)行臨床評估通常采用的是北京協(xié)和醫(yī)院鮑秀蘭教授提出的20項新生兒行為神經(jīng)測定(NBNA)評分。該評分法結(jié)合了美國Brazelton新生兒行為測定和法國Ameil-Tison神經(jīng)運(yùn)動測定方法的優(yōu)點，具有可操作性強(qiáng)、可信度高、靈敏度及特異度高的優(yōu)點[5-6]。

目前HIE輔助檢查主要包括顱腦彩超、頭顱CT、核磁共振、腦電圖等，但是越來越多臨床研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷標(biāo)志物水平可預(yù)測神經(jīng)系統(tǒng)是否存在病理損傷[7-9]，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)研究熱點。神經(jīng)損傷標(biāo)志物大多是與神經(jīng)組織密切相關(guān)的生物蛋白，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到一定程度損傷時，此類生物蛋白將會發(fā)生特異性改變，常見神經(jīng)損傷標(biāo)志物有S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1)和髓鞘堿性蛋白(MBP)、膠原纖維酸性蛋白(GFAP)等。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞骨架蛋白，正常情況下，GFAP在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外自發(fā)降解，通過腦脊液循環(huán)于腦室系統(tǒng)與脊髓中，血中GFAP水平較穩(wěn)定；當(dāng)腦部發(fā)生損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增生導(dǎo)致GFAP表達(dá)增加，GFAP通過血腦屏障進(jìn)入血液中，使得血中GFAP水平上調(diào)[10]。故本研究對不同病情嚴(yán)重程度、不同日齡足月HIE患兒的血清GFAP水平、NBNA評分情況及二者之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期對HIE患兒的早期診斷、病情嚴(yán)重程度、預(yù)后判斷以及指導(dǎo)臨床治療提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2019年12月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院收治的90例診斷為HIE的新生兒作為HIE組，依據(jù)病情嚴(yán)重程度將患兒分為輕度組(40例)、中度組(28例)、重度組(22例)，并隨機(jī)選取同時期產(chǎn)科70例健康足月新生兒作為本臨床試驗對照組。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，各研究對象家屬均已簽署臨床試驗知情同意書。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) HIE組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患兒均為足月兒(胎齡37～42周)；(2)出生體質(zhì)量2.5～4.0 kg；(3)患兒均符合2005年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會新生兒組制訂的HIE臨床診斷及分度標(biāo)準(zhǔn)[11]。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)胎齡37～42周；(2)出生體質(zhì)量2.5～4.0 kg；(3)有正常的Apgar評分；(4)孕母在妊娠期身體健康；(5)新生兒無先天畸形、窒息史及神經(jīng)系統(tǒng)病癥等表現(xiàn)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及GFAP檢測 所有納入本研究的新生兒在日齡1、3、7 d時分別采集外周靜脈血2～3 mL。將采集的血液標(biāo)本靜置5～10 min后離心，設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心時間為10 min，離心后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清GFAP水平，人GFAP ELISA試劑盒(ab223867)由上海艾博抗公司提供。用已知濃度的GFAP抗體包被微孔酶標(biāo)板，制成相對抗體，向包被單抗的微孔酶標(biāo)板中依次加入待檢測血清標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品，待檢測標(biāo)本中的人GFAP與生物素和親和素相結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)徹底洗滌后加顯色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB在辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，在終止液的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺與待測標(biāo)本中GFAP水平呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中GFAP水平。

1.3.2NBNA評分 分別在新生兒日齡3、7 d時進(jìn)行NBNA評分。NBNA評分內(nèi)容包括新生兒行為能力、主動肌張力、被動肌張力、原始反射、一般評估5個部分共20項，以上每項評分有3個分度(0、1、2分)，總分0～40分，評分>35分為合格，評分≤35分則記為不合格，提示有腦損傷。

1.3.3資料收集 收集所有受試新生兒胎齡、出生體質(zhì)量、性別、分娩方式等一般資料。

2 結(jié) 果

2.1各組一般資料比較 HIE各亞組和對照組間胎齡、出生體質(zhì)量、性別比例、分娩方式比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2各組血清GFAP水平比較 同一時間點各組間血清GAFP水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中：日齡1、3 d時HIE各亞組均明顯高于對照組，日齡7 d時中、重度組高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；同一時間點HIE各亞組間兩兩比較比較，日齡1 d時重度組高于輕、中度組，日齡3 d、7 d時中、重度組高于輕度組且重度組高于中度組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016 7)。HIE各亞組不同時間點血清GAFP水平比較：輕度組日齡3 d時較日齡1 d時明顯上升，日齡7 d時較日齡1、3 d時均有所下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中、重度組日齡3、7 d時較日齡1 d時明顯上升，日齡7 d時較日齡3 d時有所下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組新生兒血清GFAP水平變化趨勢圖

表2 各組間及不同時間點血清GFAP水平比較

2.3各組NBNA評分比較 日齡3 d時HIE各亞組NBNA評分均明顯低于對照組，日齡7 d時中、重度組明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而輕度組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；同一時間點HIE各亞組兩兩比較，日齡3、7 d時輕、中、重度組NBNA評分依次呈遞減趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016 7)；日齡7 d時，HIE各亞組NBNA評分均較日齡3 d時升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組日齡3、7 d時NBNA評分比較分)

2.4日齡3、7 d時的HIE組血清GFAP水平與NBNA評分的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，日齡3、7 d時，HIE組血清GFAP水平與NBNA評分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。見圖2。

注：A、B分別為日齡3、7 d時HIE組血清GFAP水平與NBNA評分間關(guān)系散點圖。

3 討 論

HIE與感染性腦損傷、膽紅素腦病并稱為新生兒三大腦損傷疾病[12]。HIE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種機(jī)制與途徑共同導(dǎo)致的急性或慢性腦損傷。HIE可發(fā)生在圍生期任何階段，分娩前、分娩時、分娩后的多種因素均可導(dǎo)致缺氧缺血性腦損傷[13-14]。而HIE新生兒的干預(yù)時機(jī)十分重要，臨床醫(yī)生需要早期發(fā)現(xiàn)其行為神經(jīng)異常表現(xiàn)。因此，新生兒行為神經(jīng)檢查是近20年來國際兒科領(lǐng)域重要進(jìn)展及研究重點之一。通過對新生兒行為神經(jīng)進(jìn)行合理評估，可以全面、完善、精細(xì)地評估新生兒的精神狀態(tài)、行為能力和各種神經(jīng)反射。目前我國通常采用北京協(xié)和醫(yī)院鮑秀蘭教授制訂的NBNA評分法。相對于其他行為神經(jīng)評估法而言，NBNA評分簡單，培訓(xùn)時間短，檢查時間僅需10 min，具有可操作性強(qiáng)，可反復(fù)測定，無痛苦，以及無傷害等特點，其結(jié)果可靠，靈敏度及特異度高。另一方面，NBNA評分是基于中國新生兒制訂，能更加全面地評價新生兒的行為能力，也是我國臨床上目前使用最為廣泛的一種新生兒行為神經(jīng)評定方法。

隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展，分子生物學(xué)病理診斷對早期發(fā)現(xiàn)病變有重要意義。疾病早期，血清標(biāo)志物的出現(xiàn)往往早于組織學(xué)病變[15]，因此，在疾病早期加強(qiáng)對血清標(biāo)志物檢測，有利于更早發(fā)現(xiàn)異常，進(jìn)而彌補(bǔ)目前傳統(tǒng)輔助檢查的缺陷與不足?；诖耍窠?jīng)損傷標(biāo)志物在臨床上對HIE患兒早期診斷具有指導(dǎo)意義?，F(xiàn)今為止，已有超過120種血清神經(jīng)損傷標(biāo)志生物蛋白被具體描述[16]，臨床研究較多的神經(jīng)損傷標(biāo)志物主要包括GFAP、NSE、S100B、UCHL-1、MBP等。其中，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞中的一種細(xì)胞骨架蛋白，在神經(jīng)再生和維持星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)功能正常具有重要作用[17]。星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)元與毛細(xì)血管壁共同組成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血腦屏障，因此，腦脊液或血清中GFAP水平在一定程度上可反映血腦屏障功能[18]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生，主要表現(xiàn)為GFAP快速合成，并且在血清中或腦脊液中水平增加。因此，有學(xué)者認(rèn)為，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活增多可以間接反映出神經(jīng)損傷的嚴(yán)重程度，故血清或腦脊液GFAP水平可作為評估腦部受損與否及受損程度的新型指標(biāo)[19]。

本研究通過對不同日齡各亞組HIE患兒血清GFAP水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不論其病情輕重，在日齡1 d時，血清GFAP水平較對照組均有所上升(P<0.01)，提示HIE患兒發(fā)病早期，血清GFAP水平即發(fā)生異常。對不同病情嚴(yán)重程度HIE患兒血清標(biāo)本進(jìn)行檢測分析發(fā)現(xiàn)，血清GFAP水平在日齡3、7 d時隨病情嚴(yán)重程度加重而升高，即輕度組低于中度組，中度組低于重度組，與既往的研究結(jié)果相一致[9]。另外在不同時間點對HIE各亞組血清GFAP水平進(jìn)行比較，日齡3 d時血清GFAP水平最高，考慮其原因可能為此階段大腦處于損傷極期，腦組織及神經(jīng)元發(fā)生壞死、腦水腫、腦出血、腦梗死等病理改變，致使血腦屏障通透性增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)受破壞，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，星形膠質(zhì)細(xì)胞的壞死及活化增生刺激GFAP大量合成釋放，導(dǎo)致血清GFAP水平升高。有臨床試驗表明，HIE患兒在出生后3～4 d血清GFAP水平的變化可預(yù)測其腦損傷程度及遠(yuǎn)期的運(yùn)動發(fā)育狀況[10]。

本研究對納入的研究對象進(jìn)行NBNA評分，結(jié)果顯示HIE組不論病情輕重，在日齡3 d時NBNA評分均低于對照組(P<0.01)，且HIE各亞組間比較，日齡3、7 d時輕度組、中度組和重度組NBNA評分依次呈遞減趨勢(P<0.016 7)；當(dāng)日齡7 d時，輕度組HIE患兒NBNA評分有所恢復(fù)，與對照組新生兒差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而中度組與重度組依然低于對照組(P<0.016 7)。本研究中HIE各亞組的NBNA評分在日齡3 d時NBNA評分低，提示對日齡3 d以內(nèi)的HIE患兒應(yīng)仔細(xì)觀察其行為神經(jīng)狀態(tài)，并予以適當(dāng)?shù)牧夹源碳ぃ纳苹純侯A(yù)后。

本研究分析了日齡3、7 d時HIE患兒GFAP水平與NBNA評分的相關(guān)性，結(jié)果提示血清GFAP水平越高，患兒NBNA評分越低，二者呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。研究表明，HIE患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一為大腦缺血區(qū)域細(xì)胞死亡范圍擴(kuò)大導(dǎo)致的再灌注損傷，而再灌注損傷發(fā)生時間為30 min到72 h不等[20]。因此，在日齡3 d時，HIE患兒在此時的腦損傷程度可能最為嚴(yán)重，大腦處在極度缺氧缺血狀態(tài)，成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞大量合成、分泌GFAP，故此時血清GFAP水平最高，且此時神經(jīng)行為功能低下，致使NBNA評分最低。在經(jīng)過積極治療后，HIE患兒的缺氧缺血狀態(tài)得到改善，神經(jīng)元細(xì)胞再次得到營養(yǎng)供給，神經(jīng)系統(tǒng)功能得以恢復(fù)，此時的血清GFAP水平有所下降，而NBNA評分也相應(yīng)上升。

綜上所述，HIE患兒的血清GFAP水平與NBNA評分呈負(fù)相關(guān)，提示兩個指標(biāo)可共同作為HIE患兒早期診斷指標(biāo)并反映其病情嚴(yán)重程度，可以指導(dǎo)治療，對降低HIE患兒的病死率有重要意義，從而輔助改善HIE患兒的預(yù)后。但本研究只觀察了日齡7 d內(nèi)的HIE患兒血清GFAP水平及NBNA評分情況，時間較短，對預(yù)測HIE患兒預(yù)后價值有限，需進(jìn)一步行隨訪研究。