Gal-3、COX-2在異位內(nèi)膜組織中的表達水平及其預測價值分析*

周立琴，張新圓

1.新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院婦科，新疆克拉瑪依 834000；2.烏魯木齊市第一人民醫(yī)院婦一科，新疆烏魯木齊 830011

子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是育齡期女性多發(fā)疾病。異位內(nèi)膜侵襲周圍組織，容易形成異位結節(jié)，引發(fā)不孕、盆腔疼痛等癥狀，影響患者生活質(zhì)量。目前，臨床對于有生育需求的EM患者，多采用腹腔鏡保守性手術切除異位內(nèi)膜病灶，遏制疾病進展[1]。但研究發(fā)現(xiàn)，腹腔鏡手術后約40%的EM患者可能會出現(xiàn)復發(fā)情況，增加二次手術風險，影響患者預后[2]?，F(xiàn)階段臨床評估EM術后復發(fā)多依靠盆腔檢查、B超檢查等，此類檢查方式雖可明確病灶變化，但無法定量分析復發(fā)風險，應用存在局限[3]。研究發(fā)現(xiàn)，EM的發(fā)生、發(fā)展與異位內(nèi)膜細胞黏附、新血管生成等密切相關[4]。半乳糖凝集素-3(Gal-3)是一種細胞凝集素，其可參與細胞黏附、炎癥反應、新血管生成等多種生理過程，調(diào)控細胞遷移、增殖等[5]。環(huán)氧合酶-2(COX-2)作為前列腺素合成重要限速酶，在多種激素作用下可介導炎癥反應，調(diào)控細胞增殖，且可參與EM血管生成[6]。結合Gal-3、COX-2作用機制，推測二者可能與EM患者腹腔鏡手術治療預后有關，但具體關系尚未明確。鑒于此，本研究重點分析異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平與EM患者腹腔鏡手術治療預后的關系及其對患者手術治療預后不良風險的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究的開展獲得新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。選取2019年1月至2020年5月在新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院擇期行腹腔鏡手術治療的107例EM患者作為研究對象，全部患者及家屬均知情同意并簽訂了知情同意書。收集患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、病程等一般資料。EM患者年齡23～44歲、平均(33.52±2.14)歲，平均BMI為(21.08±1.03)kg/m2，病程1～6年、平均(3.07±0.72)年。

1.2納入、排除標準 納入標準：(1)EM診斷符合《子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南》[7]中相關診斷標準，且經(jīng)異位病灶活檢確診；(2)具有腹腔鏡手術指征，且均為初次接受腹腔鏡保守性手術治療；(3)年齡≥18歲；(4)免疫系統(tǒng)、凝血功能正常；(5)精神正常，可配合研究；(6)均獲得隨訪。排除標準：(1)合并子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌等惡性腫瘤患者；(2)病灶廣泛浸入周圍組織，與盆腔粘連或形成冷凍骨盆的患者；(3)病灶侵犯卵巢門部，影響卵巢血供的患者；(4)雙側卵巢巧克力囊腫最大徑≥15 cm患者；(5)合并心肝腎等重要臟器病變患者；(6)合并其他子宮疾??；(7)術前接受激素或其他相關治療患者；(8)合并炎癥性疾病患者；(9)哺乳或妊娠期患者。

1.3方法

1.3.1基線資料收集 設計基線資料填寫表，詢問并記錄患者相關基線資料，包括：病變類型(膜腹型、卵巢型、深部浸潤型)、不孕情況、r-AFS分期[8](Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期)、既往盆腔手術史等。

1.3.2儀器與試劑 高速離心機TGL-16.5M購自濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司；聚合酶鏈反應(PCR)分析儀Lepgen-96購自濟南千司生物技術有限公司；Trizol裂解液、反轉錄試劑盒及相關試劑均購自美國Promega公司。

1.3.3異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平檢測 取約200 mg異位病灶組織置于無菌試管內(nèi)，添加1 mL Trizol裂解液，劇烈振蕩后在室溫下靜置5 min，然后添加200 μL氯仿振蕩15 s，室溫下靜置10 min；在4 ℃環(huán)境下用高速離心機以12 000 r/min轉速、10 cm離心半徑離心15 min；取上層水相置于新的離心管，添加等體積異丙醇，混勻后，以同樣轉速、離心半徑離心15 min，棄層清液，添加75%乙醇，再次以同樣轉速、離心半徑離心5 min，棄上清液，在室溫下靜置10 min，最后添加20～60 μL ddH2O，完成樣本總RNA提取；用5×PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒提取樣本總cDNA，反轉錄反應體系共10 μL，反應條件：先95 ℃預變性3 min，然后依次94 ℃反應15 s、55 ℃反應15 s、72 ℃反應30 s，反轉錄結束將cDNA樣本置于-20 ℃環(huán)境下貯存；取cDNA樣本進行PCR擴增反應，反應前先用RNase水將樣本稀釋20倍，反應體系共2 510 μL，反應條件：先95 ℃預變性3 min，然后依次95 ℃反應5 s、60 ℃退火、延伸40 s，設定40個循環(huán)，最后用2-ΔΔCt法計算Gal-3、COX-2相對表達量。

1.3.4隨訪 全部患者術后均接受1年隨訪，將隨訪期內(nèi)復發(fā)情況作為預后觀察指標，復發(fā)患者納入預后不良組，未復發(fā)患者納入預后良好組。是否復發(fā)判斷標準：(1)臨床體征，痛經(jīng)、月經(jīng)異常等癥狀消失后再次出現(xiàn)，或癥狀減輕后再次加重；(2)盆腔檢查，盆腔陽性體征消失后再次出現(xiàn)，或陽性體征緩解后再加重；(3)B超檢查，可見新的內(nèi)膜異位病灶。

2 結 果

2.1EM患者腹腔鏡手術治療預后情況 隨訪1年，107例EM患者中預后不良42例，占39.25%，預后良好65例，占60.75%。

2.2兩組基線資料及異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平比較 預后不良組r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ期患者占比及異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平高于預后良好組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組其他基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組基線資料及異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平比較

2.3EM患者異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平的相關性分析 Spearman雙變量相關分析結果顯示，EM患者異位內(nèi)膜組織中Gal-3表達水平與COX-2呈正相關(r=0.426，P<0.001)。見圖1。

圖1 異位內(nèi)膜組織中Gal-3表達水平與COX-2間關系散點圖

2.4EM患者腹腔鏡手術治療預后影響因素的Logistic回歸模型分析 將2.2中差異有統(tǒng)計學意義的指標r-AFS分期(1=Ⅲ～Ⅳ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、Gal-3、COX-2(均為連續(xù)變量)作為自變量，將EM患者腹腔手術治療預后情況作為因變量(1=預后不良，0=預后良好)，經(jīng)Logistic回歸模型分析結果顯示，r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ期及Gal-3、COX-2表達水平升高可能是EM患者腹腔鏡手術治療預后不良的獨立危險因素(OR>1，P<0.05)。見表2。

表2 EM患者腹腔鏡手術治療預后影響因素的Logistic回歸模型分析

2.5異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨和聯(lián)合檢測對EM患者腹腔鏡手術治療預后不良風險的預測價值 將Gal-3、COX-2作為檢驗變量，將EM患者腹腔手術治療預后情況作為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，結果顯示，異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨及聯(lián)合檢測預測EM患者腹腔鏡手術治療預后不良風險的AUC分別為0.871、0.875、0.932，均>0.800，均有一定預測價值；當二者cut-off值分別取1.950、3.460時，預測價值最佳。見表3。

表3 異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2預測EM患者腹腔鏡手術治療預后不良風險的價值

圖2 異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨及聯(lián)合檢測預測EM患者腹腔鏡手術治療預后不良風險的ROC曲線

3 討 論

EM病因復雜，多認為與內(nèi)膜種植、免疫系統(tǒng)異常、炎癥等因素有關。據(jù)報道，EM發(fā)生率為10%～15%，且近年來發(fā)生率逐年升高[9]。腹腔鏡保守性手術作為EM常用術式，雖可有效切除異位病灶，保留患者生育功能，但術后容易出現(xiàn)復發(fā)情況，影響患者預后[10]。因此，明確可能與EM患者腹腔鏡手術復發(fā)有關指標，對指導早期干預、改善患者預后有積極意義。

報道指出，重癥EM患者術后復發(fā)率明顯高于輕癥患者，且隨著病情的加重，復發(fā)風險增加[11]。r-AFS分期是評估EM病情嚴重程度常用方式，其評估內(nèi)容主要包括病灶大小、粘連程度2個方面，可指導臨床選擇適宜治療方案[12]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ可能是EM患者腹腔鏡手術治療預后不良的獨立危險因素(OR>1，P<0.05)，與董立娜等[13]研究結果一致。但r-AFS分期評估有一定主觀性，且無法預測患者術后復發(fā)風險，應用存有一定局限。Gal-3是一種半乳糖結合蛋白，其主要表達于上皮細胞、纖維原細胞等，通過結合信號分子ras蛋白、細胞外基質(zhì)等，可發(fā)揮促細胞增殖作用[14]。研究表明，Gal-3的C端CRD基序可結合血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子等細胞表面特異性受體，促進新血管生成，且可特異性結合細胞表糖蛋白，增強細胞黏附作用，誘導內(nèi)皮細胞增殖、分化[15]。此外，Gal-3還可參與輔助性T細胞2免疫應答，影響免疫細胞對異位內(nèi)膜的清除能力，參與子宮內(nèi)膜疾病發(fā)生過程[16]。COX-2一種環(huán)氧合酶重要同工酶，其多被認為是快速反應基因，通常情況下組織活性低、表達量少，但當細胞受炎癥、生長因子等刺激時，COX-2會快速合成[17]。據(jù)報道，COX-2可參與炎癥反應、促進血管內(nèi)皮生長因子生成，從而加速細胞生長、增殖[18]。目前已有研究證實，COX-2可促進腫瘤細胞增殖、分化過程，且可增強腫瘤細胞侵襲能力，促進腫瘤轉移[19]。由于EM侵襲生物學行為與惡性腫瘤相似，吳敏等[20]研究觀察COX-2在EM中表達情況，結果顯示，EM患者內(nèi)膜組織中COX-2表達水平顯著高于在位內(nèi)膜及健康人，且r-AFS分期越高，COX-2表達水平越高。結合Gal-3、COX-2作用機制，推測二者可能與EM患者腹腔鏡手術治療預后有關。

為驗證Gal-3、COX-2表達水平與EM患者腹腔鏡手術治療預后的關系，本研究證實了兩組異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，經(jīng)Spearman雙變量相關分析結果顯示，EM患者異位內(nèi)膜組織中Gal-3表達水平與COX-2呈正相關(r=0.426，P<0.001)，并經(jīng)Logistic回歸模型分析進一步發(fā)現(xiàn)了Gal-3、COX-2表達水平可能是EM患者腹腔鏡手術治療預后不良的獨立危險因素(OR>1，P<0.05)。分析原因在于，異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平升高，可能會促進術后殘存內(nèi)膜組織新血管生成，加速內(nèi)膜組織增殖、分化，從而可能會增加內(nèi)膜組織再次異位風險，導致疾病復發(fā)，影響EM患者預后[21]。本研究最后繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨及聯(lián)合檢測預測EM患者腹腔鏡手術治療預后不良風險均有理想的價值，在二者cut-off值分別取1.950、3.460時，可獲得最佳預測價值，且隨著Gal-3、COX-2表達水平升高，患者預后不良風險增加。因此，建議對異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平升高的EM患者，腹腔鏡手術后臨床應早期予以孕激素類藥物干預，并囑咐患者盡早懷孕，預防疾病復發(fā)，改善患者預后。但本研究結果存在一定局限性，未來仍需積累更多樣本量展開前瞻性研究加以驗證。

綜上所述，EM患者腹腔鏡手術治療預后不良可能與異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達水平升高有關，且Gal-3、COX-2對EM患者腹腔鏡手術治療預后不良風險有一定預測價值，未來可考慮檢測異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2水平，輔助評估EM患者術后預后不良風險。