益氣活血方對(duì)心衰大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的影響及其機(jī)制探討*

邢俊娥，吳 鵬，李海沅

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530001

心力衰竭（簡(jiǎn)稱“心衰”）是由多種原因?qū)е滦募∈湛s和（或）舒張功能受損，引起心臟泵血功能障礙，是多種器質(zhì)性心臟疾病的終末階段，目前已成為心血管疾病的主要死亡原因［1-2］，《中國(guó)心血管病報(bào)告2016》指出，我國(guó)心衰患病率約為1%，約450萬人［3］，且隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)病率及病死率逐步提升［4-5］。目前認(rèn)為心衰的病理生理機(jī)制為心室重構(gòu)，心肌細(xì)胞凋亡又是心室重構(gòu)的重要原因，心肌細(xì)胞能量代謝紊亂和凋亡已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。線粒體為細(xì)胞能量代謝的主要器官，線粒體結(jié)構(gòu)與功能改變可參與細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致心肌代謝重構(gòu)，引起慢性心衰［6］；同時(shí)在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中線粒體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮了重要作用［7］；因此在心力衰竭的治療中，改善線粒體功能是其重要環(huán)節(jié)［8］。有關(guān)益氣活血方的前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)改善心肌細(xì)胞凋亡，治療慢性心衰有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［9］，本研究進(jìn)一步從線粒體功能方面探討益氣活血方對(duì)心衰大鼠的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量（210±20）g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK桂2013-0005。所有大鼠飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，常溫飼養(yǎng)，自由飲水，所食飼料均為標(biāo)準(zhǔn)合成大鼠飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥及主要試劑益氣活血方（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供）。藥物組成：黨參15 g，黃芪15 g，麥冬10 g，五味子12 g，丹參15 g，赤芍15 g，川芎12 g，茯神10 g，炙甘草8 g等。將上述藥物制成每毫升含生藥1.52 g的溶液（80%的混懸液）。鹽酸多柔比星粉針劑(阿霉素，浙江海正藥業(yè)股份有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980；規(guī)格：10 mg/支）；依那普利片(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字H10980305；規(guī)格：10 mg/片)。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）和活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1,南京凱基生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備XMT-142型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海儀表有限公司）；轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）；LG16-W型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；Spectra Max L型微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Molecular Devices公司）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型制備 大鼠飼養(yǎng)1周后隨機(jī)取15只為正常組，剩余75只進(jìn)行造模，制備阿霉素誘導(dǎo)的心衰模型，將阿霉素用生理水配制成2.0 mg/mL溶液，以1.5 mL/kg腹腔注射，每周注射1次，連續(xù)4周，并通過超聲心動(dòng)圖檢測(cè)造模是否成功。造模4周后將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、依那普利組及益氣活血方低、中、高劑量組。

1.4.2 給藥方法 按照大鼠體質(zhì)量及體表面積法換算給藥劑量。益氣活血湯低、中、高劑量組分別予益氣活血湯0.7、1.4、2.8 g/（kg·d）灌胃，依那普利組將依那普利片用蒸餾水配成混懸液［5.0 mg/（kg·d）］灌胃，正常組與模型組每天予等量生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)灌胃6周。

1.4.3 心功能檢查 藥物干預(yù)6周后將大鼠麻醉平臥位固定，并將心臟探頭置于左心室長(zhǎng)軸最大直徑處標(biāo)記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內(nèi)膜位置，自動(dòng)計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室射血分?jǐn)?shù)縮短(left ventricular fraction shortening，LVFS)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)，取3個(gè)心動(dòng)周期求平均值；超聲測(cè)量后處死大鼠收集新鮮心肌組織標(biāo)本冰凍，待測(cè)。

1.4.4 ATP含量測(cè)定 給藥6周后處死大鼠，取適量的心肌組織，裂解細(xì)胞，4℃離心半徑30 cm，1.2×104 r/min離心12 min，取上清液。在96孔板中加入100μL ATP檢測(cè)液，常溫放置5 min左右，再加入50μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，采用酶標(biāo)儀測(cè)定相對(duì)光單位（relative light unit，RLU）值。

1.4.5 ROS水平測(cè)定 給藥6周后處死大鼠，取適量的心肌組織，裂解細(xì)胞，采用10μmol/L DCFH-DA溶液重懸，37℃細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20 min。每3～5 min顛倒一下，讓探針與細(xì)胞充分接觸。用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，最后用200μL磷酸緩沖鹽（PBS）進(jìn)行重懸，采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定ROS。

1.4.6 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）測(cè)定 取新鮮心肌組織約100 mg，剪碎，加胰蛋白酶孵育，進(jìn)行勻漿，離心后分離出線粒體，將新鮮配制的JC-1檢測(cè)液加入到線粒體液體中，常溫下避光，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。提前設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃），熒光顯微鏡濾波器激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，散發(fā)波長(zhǎng)為590 nm（線粒體鈣離子呈現(xiàn)紅色）；激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，散發(fā)波長(zhǎng)為530 nm（線粒體鈣離子呈現(xiàn)綠色）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù)，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能與正常組比較，模型組LVEF、LVFS減低，LVEDD、LVESD增長(zhǎng)（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組LVEF和LVFS升高（P＜0.05），LVEDD和LVESD縮短（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心臟超聲參數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠心臟超聲參數(shù)比較（±s）

注：與正常組比較，△表示P＜0.05；與模型組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01；與依那普利組比較，▽表示P＞0.05

組別例數(shù)LVEDD（mm）LVESD（mm）LVFS（%）LVEF（%）正常組模型組益氣活血方低劑量組益氣活血方中劑量組益氣活血方高劑量組依那普利組15 15 15 15 15 15 6.48±0.11 8.21±0.43△8.01±0.12 7.78±0.35 7.05±0.28▲▽7.09±0.45▲3.71±0.28 7.20±0.51△6.68±0.60 6.32±0.35 5.49±0.15▲▽5.38±0.74▲47.92±2.75 30.71±2.96△33.45±1.88▲36.52±2.56▲40.18±2.14▲▲▽41.22±1.61▲▲86.01±2.29 45.73±3.54△50.30±1.38▲55.82±2.91▲59.08±3.14▲▲▽58.21±2.95▲▲

2.2 心肌細(xì)胞中ATP、ROS及MMP水平與正常組比較，模型組ROS升高，ATP、MMP降低；與模型組比較，各給藥組ROS下降，其中益氣活血方中劑量組下降最明顯（P＜0.05），而ATP水平和MMP升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），益氣活血方高劑量組與依那普利組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞中ATP、ROS及MMP水平（±s）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞中ATP、ROS及MMP水平（±s）

注：與正常組比較，△表示P＜0.05；與模型組比較，▲表示P＜0.05；與依那普利組比較，▽表示P＞0.05

組別正常組模型組益氣活血方低劑量組益氣活血方中劑量組益氣活血方高劑量組依那普利組例數(shù)15 15 15 15 15 15 ATP（μmol/L）0.167±0.340 0.093±0.018△0.259±0.024△▲0.389±0.145△▲0.276±0.073△▲▽0.275±0.690△▲ROS（U/L）44.22±2.47 69.04±3.07△52.97±3.16△▲50.63±0.57△▲51.77±0.19△▲▽51.56±0.12△▲MMP（ng/mL）1.368±2.120 0.617±0.120△1.613±0.117△▲2.591±0.145△▲2.456±0.139△▽2.335±0.026△▲

3 討論

心力衰竭是由于各種心臟病變和長(zhǎng)期心臟負(fù)荷過重，導(dǎo)致心室肌收縮力下降不能滿足機(jī)體代謝需要的一種疾病。心力衰竭屬中醫(yī)“心衰”“心悸”“脫征”范疇［10］。其病位主要在心，病理特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)，以陽氣虛衰為本，血虛、痰飲、水濕為標(biāo)。益氣活血方中黨參補(bǔ)氣，黃芪升發(fā)陽氣為主藥，輔助人參提升心陽；麥冬、五味子益氣養(yǎng)陰生津；佐以赤芍、丹參、川芎活血通脈，茯神穩(wěn)心定神。諸藥配伍，具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀，振奮心陽之功效。藥理研究發(fā)現(xiàn)在心肌缺血疾病治療方面黃芪甲苷等多種中藥成份可能起重要作用［11］。黃芪總皂苷可抗心力衰竭，改善心肌供血，促進(jìn)血管新生［12］。吳正國(guó)發(fā)現(xiàn)［13］常規(guī)治療的基礎(chǔ)上聯(lián)用黃芪注射液可明顯提高心力衰竭患者治療的有效率并改善心功能。研究發(fā)現(xiàn)，三七、黃芪等中藥具有清除氧自由基，抗氧化應(yīng)激，抗動(dòng)脈粥樣硬化以及保護(hù)心臟細(xì)胞等作用［14-15］。人參能興奮中樞神經(jīng)，增加腎上腺皮質(zhì)功能，抗疲勞；五味子和麥冬均能增強(qiáng)心肌收縮力，前者對(duì)呼吸有興奮作用；后者可加速冠脈血流量和心臟輸出量。有研究發(fā)現(xiàn)益氣活血法可以激活心肌能量代謝通路，增加心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體濃度，提高線粒體功能，繼而改善心肌細(xì)胞能量代謝［16-17］。同時(shí)應(yīng)用活血益氣中藥可抑制心衰大鼠左室重構(gòu)和心肌細(xì)胞凋亡［18］。

本研究提示各藥物干預(yù)組LVEF和LVFS均提高，高劑量組和依那普利組與模型組LVEDD、LVESD水平降低；在正常氧化應(yīng)激條件下，心肌細(xì)胞線粒體ROS生成顯著增加，給予益氣活血方干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ATP水平及MMP升高，ROS含量降低。心肌正常的能量代謝是保證心臟舒縮功能和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的物質(zhì)基礎(chǔ)，能量供應(yīng)障礙可導(dǎo)致慢性心衰的發(fā)生，作為能量的供應(yīng)場(chǎng)所線粒體功能下降在慢性心衰中起重要作用［19］，ATP和ROS是構(gòu)成心肌細(xì)胞線粒體的主要能量物質(zhì)，其中ATP直接提供能量，而ROS作用相反，ROS能導(dǎo)致心肌細(xì)胞氧化損傷，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡，線粒體功能是否正常對(duì)保證細(xì)胞機(jī)能起關(guān)鍵作用［20］，其結(jié)構(gòu)和功能的異?？梢詫?dǎo)致心肌細(xì)胞供能減少，改變氧化還原系統(tǒng)［21］，而線粒體也是氧化應(yīng)激的主要發(fā)生場(chǎng)所［22］，心力衰竭發(fā)生時(shí)脂肪酸的氧化分解下降并堆積在心肌細(xì)胞內(nèi)，繼發(fā)線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白（UCP）生成過多，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）持續(xù)開放，加快ROS的生成，ROS通過降解線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量以及加快DNA結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)而導(dǎo)致ATP的產(chǎn)生下降［23］。因此，慢性心衰后組織恢復(fù)氧灌注會(huì)引起劇烈的線粒體氧化應(yīng)激，從而最終導(dǎo)致線粒體功能障礙，表現(xiàn)為MMP、ATP降低，ROS升高等。臨床研究發(fā)現(xiàn)［24］應(yīng)用中藥制劑可降低心力衰竭大鼠線粒體跨膜電位下降的心肌細(xì)胞比例，增加心肌組織ATP合成能力。因此，氧化應(yīng)激的預(yù)防被認(rèn)為是減輕心衰導(dǎo)致心肌損傷的一種重要治療策略［25］。

本研究結(jié)果顯示，益氣活血方可使細(xì)胞內(nèi)ATP水平及MMP升高，ROS含量降低，說明益氣活血方可通過抑制ROS的產(chǎn)生從而改善線粒體的能量代謝，保護(hù)心肌，減少心肌細(xì)胞的破損和凋亡，調(diào)控心室重構(gòu)，延緩慢性心力衰竭的病程，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。