UPLC-MS/MS 分析綠茶中12 種酚酸類物質(zhì)

盧 專，黃永橋，于以竹，毛敏霞，簡(jiǎn)銀池，吳新文

（貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州貴陽(yáng) 550014）

關(guān)鍵字：綠茶；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；酚酸

茶葉因其特殊風(fēng)味和保健功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。茶葉中富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，如茶多酚、咖啡堿、氨基酸、有機(jī)酸、茶多糖及礦物元素等，其中酚酸類化合物含量約占鮮葉干重的5%[1-2]。酚酸類物質(zhì)主要是沒(méi)食子酸、咖啡酸等形成的簡(jiǎn)單酚酸和奎寧酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸等形成的縮合衍生物，如鞣花酸、間雙沒(méi)食子酸、綠原酸等[3-4]。研究表明，酚酸在許多藥用植物中作為活性成分發(fā)揮藥理作用，如綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增高白細(xì)胞及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功效；鞣花酸具有抗菌、抗突變、抗癌及增白等功效[5-7]。因此茶葉中酚酸化合物的含量測(cè)定對(duì)其生物活性研究具有重要意義。

目前，酚酸化合物的含量測(cè)定方法主要有薄層色譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、高效液相色譜法[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13-15]、氣相色譜法[16]和氣相色譜-質(zhì)譜法[17]等。高效色譜-質(zhì)譜法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)和結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，是測(cè)定酚酸含量常用的分析方法之一。

本研究以遵義市、都勻市、雷山縣3 個(gè)地區(qū)的綠茶作為研究對(duì)象，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，通過(guò)優(yōu)化儀器及前處理?xiàng)l件，建立分析測(cè)定方法，并對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。通過(guò)建立的分析測(cè)定方法對(duì)不同產(chǎn)地的綠茶進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算各酚酸的含量，通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的綠茶中12 種酚酸物質(zhì)含量差異進(jìn)行分析，探討酚酸含量的差異與產(chǎn)地是否存在聯(lián)系，以期為茶葉化學(xué)分類方法提供更多的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純），德國(guó)Merck 公司；沒(méi)食子酸（99.35%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；甲酸（色譜純）、鞣花酸（99.9%），上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、咖啡酸、對(duì)香豆酸和鄰香豆酸（純度＞95%），天津阿爾塔科技有限公司；間雙沒(méi)食子酸（98.2%），美國(guó)Cayman 公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

茶葉樣品分別購(gòu)自湄潭、雷山、都勻3 個(gè)地區(qū)茶葉生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的60 批次綠茶，均選取當(dāng)?shù)夭枞~進(jìn)行生產(chǎn)的綠茶，其中湄潭24 批次、雷山23 批次、都勻13 批次。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四極桿質(zhì)譜儀（Agilent 6470，配ESI 源）、超高效液相色譜儀（Agilent 1290），美國(guó)Agilent 公司；GM200 刀式研磨粉碎儀，德國(guó)Retsch 公司；超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；UMV-2 多管渦旋混合器，北京普立泰科儀器有限公司；L-550 離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Milli-Q 超純水機(jī)，美國(guó)Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取上述12 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入甲醇溶解并定容至刻度，配制濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃保存。用80%甲醇溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制濃度為0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL 和10.00 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 色譜條件

色 譜 柱ZORBAX Eclipse Plus-C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）， 美 國(guó)Agilent 公 司； 流 速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積2.0 μL；流動(dòng)相A 為0.1%乙酸水溶液，B 為乙腈。

梯 度 洗 脫 程 序 為0 ～0.5 min，2.0%B；0.5 ～6.0 min，2.0% ～16.0%B；6.0 ～9.0 min，16.0% ～42.0%B；9.0 ～10.0 min，42.0% ～46.0%B；10.00 ～10.01 min，46.0%～95.0%B；10.01 ～11.00 min，95.0B%；11.00 ～11.01 min，95.0% ～2.0%B；11.01 ～12.0 min，2.0%B。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；霧化器壓力為40 psi；干燥氣流速為10 L/min；干燥氣溫度為325 ℃；鞘氣流速為10 L/min；鞘氣溫度為325 ℃；目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3.4 樣品前處理

稱取粉碎后的茶葉樣品0.50 g 于50 mL 具塞離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 80%甲醇溶液，超聲15 min，渦旋振蕩30 min，5 000 r/min 離心10 min，取上清液過(guò)膜上機(jī)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算采用Excel 2016 版，圖譜繪制采用Origin 2018 版，Bayes 判別分析采用SPSS 22.0 版。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用0.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在負(fù)離子模式下全掃描質(zhì)譜得到各目標(biāo)物一級(jí)碎片離子，優(yōu)化去簇電壓，對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到子離子特征碎片質(zhì)譜圖，選擇響應(yīng)值高、基線噪聲低的兩對(duì)離子對(duì)作為定性和定量離子對(duì)，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量及其他質(zhì)譜參數(shù)，得到最優(yōu)的質(zhì)譜條件。

2.2 色譜條件優(yōu)化

比較了Agilent Poroshell SB-a（q100 mm×2.1 mm，2.7 μm）、Agilent Poroshell SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm） 和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）。結(jié) 果 表 明，Poroshell SB-aq 和Poroshell SB-C18兩根色譜柱未能有效分離出12 種酚酸化合物，且兩根色譜柱的色譜峰響應(yīng)和峰型較差，Eclipse Plus C18色譜柱分離較好，峰形尖銳，且各物質(zhì)的響應(yīng)值均高于另外兩根色譜柱。考察了水相中加入甲酸、乙酸及甲酸銨對(duì)目標(biāo)物離子化效率和靈敏度的影響，結(jié)果表明，0.1%乙酸溶液對(duì)目標(biāo)物的分析靈敏度最好。進(jìn)一步考察以甲醇和乙腈為有機(jī)相，甲醇條件下目標(biāo)物相應(yīng)增加但對(duì)于異綠原酸A、B 和C 3 種同分異構(gòu)體分離較差。因此，選用0.1%乙酸溶液和乙腈為流動(dòng)相。采用梯度洗脫程序，12 min 內(nèi)，各物質(zhì)能較好分離，圖1 為12 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

2.3 前處理優(yōu)化

選取超純水、甲醇和乙醇作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用超純水對(duì)目標(biāo)物提取效率低于甲醇和乙醇提取溶劑的提取率。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)比不同比例的甲醇溶液和乙醇溶液的提取率。結(jié)果表明，使用80%甲醇溶液為提取溶劑時(shí)提取效率最好。實(shí)驗(yàn)前期對(duì)超聲提取和渦旋振蕩提取時(shí)間進(jìn)行考察。因此，本實(shí)驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液超聲提取15 min，渦旋振蕩提取30 min 作為樣品提取方法。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度對(duì)峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，12種酚酸在0.02 ～10.00 μg/mL，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.991，適用于定量分析。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一茶葉樣品6 份，依據(jù)建立的前處理和儀器分析方法，計(jì)算12 種酚酸含量及RSD，結(jié)果如表3 所示。RSD 在0.3%～6.4%，均小于10%，說(shuō)明方法具有良好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用同一供試品溶液分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 和24 h 時(shí)進(jìn)樣分析，計(jì)算各酚酸含量及RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表4。RSD 在1.5%～8.4%，說(shuō)明樣品保存在4 ℃、24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)（n=3）

2.5 Bayes 判別分析

使用12 種酚酸含量對(duì)3 個(gè)地區(qū)的綠茶進(jìn)行Bayes 判別分析，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，13 個(gè)都勻綠茶樣品判別率為61.5%，24 個(gè)湄潭綠茶樣品判別率為79.2%，23 個(gè)雷山綠茶樣品判別率為30.4%，判別圖總判別56.7%。因此，使用12 種酚酸含量對(duì)3個(gè)產(chǎn)地的判別效果不佳。

表5 茶葉分類判別結(jié)果

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)3 個(gè)地區(qū)綠茶中12 種酚酸化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，12 種酚酸化合物在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r＞0.991，重復(fù)性和穩(wěn)定性均小于10%。都勻、湄潭、雷山3 個(gè)產(chǎn)地的綠茶中酚酸類物質(zhì)的含量存在明顯差異，說(shuō)明茶葉產(chǎn)地的不同可能會(huì)導(dǎo)致酚酸類物質(zhì)的含量差異。使用12 種酚酸含量對(duì)不同產(chǎn)地的綠茶進(jìn)行Bayes 判別，結(jié)果表明，3 個(gè)地區(qū)綠茶的總判別率56.7%，說(shuō)明使用12 種酚酸含量能對(duì)綠茶的產(chǎn)地進(jìn)行一定的判別，但判別效果不佳，無(wú)法完全區(qū)分。本研究為茶葉的化學(xué)分類提供了一定參考，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步加大樣本量，根據(jù)現(xiàn)有成果增加更多的分析判別方法對(duì)茶葉中多種酚酸進(jìn)行比較與驗(yàn)證，并考慮結(jié)合茶葉中兒茶素、咖啡堿等成分進(jìn)行判別分析。