HPLC雙標(biāo)多測(cè)法測(cè)定銀黃口服液中7個(gè)成分的含量

欒永福，周廣濤，許麗麗, ，馬雙成，孫 磊，林永強(qiáng)*，郭東曉*

（1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 國(guó)家藥監(jiān)局膠類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；3. 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

定性和定量是藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的主要技術(shù)手段，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)則是成分定性和定量研究的關(guān)鍵因素。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)存在提純困難、價(jià)格高昂、不穩(wěn)定或毒性大等問(wèn)題，尤其隨著行業(yè)的快速發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需求也越來(lái)越大，這些都對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的供應(yīng)和使用提出了更高的要求。中藥成分復(fù)雜，采用多指標(biāo)分析測(cè)定技術(shù)才能全面地進(jìn)行藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短缺等因素限制了該技術(shù)的應(yīng)用。為解決這一問(wèn)題，目前研究使用最多的是一測(cè)多評(píng)法[1-6]，但該方法的色譜柱耐用性較差[7]，制約了該方法的應(yīng)用和推廣。雙標(biāo)多測(cè)法[8-10]是近年提出的一種新的替代對(duì)照品法，采用雙標(biāo)線(xiàn)性校正法進(jìn)行定性，其原理是以?xún)蓚€(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參照預(yù)測(cè)其他成分的保留時(shí)間，然后以雙標(biāo)化合物中一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參照物，采用最大吸收波長(zhǎng)相對(duì)校正因子法進(jìn)行定量。與一測(cè)多評(píng)法相比，雙標(biāo)多測(cè)法在儀器、色譜柱的耐用性和定性定量準(zhǔn)確度方面均有一定的優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)在藥物分析檢測(cè)領(lǐng)域有了較廣泛、深入的研究和應(yīng)用[11-14]。此外，目前已經(jīng)建立了科學(xué)、系統(tǒng)、完善的軟件分析工具──數(shù)字標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平臺(tái)（DRS Origin），保證雙標(biāo)線(xiàn)性校正法的科學(xué)計(jì)算與應(yīng)用。

銀黃口服液由金銀花提取物和黃芩提取物組方而成，具有清熱疏風(fēng)、利咽解毒之功效[15]，方中主要成分為6種咖啡?？鼘幩岷忘S芩苷等?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版一部項(xiàng)下，只對(duì)綠原酸和黃芩苷進(jìn)行含量控制，指標(biāo)單一，難以對(duì)質(zhì)量進(jìn)行有效控制。由于除綠原酸和黃芩苷之外的其他成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格較昂貴，因此本實(shí)驗(yàn)以DRS Origin軟件為平臺(tái)，采用雙標(biāo)多測(cè)法測(cè)定銀黃口服液中6種咖啡酰奎寧酸和黃芩苷的含量，驗(yàn)證該方法在銀黃口服液質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制中的可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫）；Sartorius CP225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Millipore Q-POD?超純水處理儀（美國(guó)Millipore公司）；26根色譜柱信息見(jiàn)表1。

表1 色譜柱信息表

1.2 材料

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201415，含量：96.2 %），3, 5-O-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品（批號(hào)：111782-201807，含量：94.3 %），4, 5-O-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品（批號(hào)：111894-201102，含量：94.1 %），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318，含量：93.3 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19031001，含量：99.67 %），隱綠原酸（批號(hào)：MUST-19032403，含量：99.07 %），3, 4-O-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)：MUST-19031602，含量：99.05 %，成都曼斯特生物科技有限公司）。乙腈，磷酸（色譜純，Merk公司），其余試劑為分析純。20批銀黃口服液樣品來(lái)源于不同生產(chǎn)企業(yè)，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 樣品信息

1.3 軟件

數(shù)字化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大數(shù)據(jù)平臺(tái)（DRS Origin）V1.0（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[15]

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5 %A→20 %A；15～30 min，20 %A→30 %A；30～40 min，30 %A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；流速：1.0 ml/min，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取新綠原酸對(duì)照品11.38 mg、綠原酸對(duì)照品11.38 mg、隱綠原酸對(duì)照品18.40 mg、3, 4-O-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品11.02 mg、3, 5-O-二咖啡酰奎寧酸對(duì)照品10.74 mg、4, 5-O-二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品10.67 mg、黃芩苷對(duì)照品23.24 mg，分別置25，25，50，25，25，25，50 ml棕色量瓶中，加50 %甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 ml，置同一100 ml棕色量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，即得每1 ml各含22.68，21.90，18.23，21.83，20.26，20.08，22.17 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品1 ml，置50 ml棕色量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 定性研究

2.4.1 色譜柱的篩選 在色譜柱1～25上采集對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖，其中在色譜柱1、色譜柱21、色譜柱23上，綠原酸和隱綠原酸峰均未達(dá)到完全分離，故以其余22根色譜柱上7個(gè)成分的保留時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4.2 雙標(biāo)化合物的選擇 將對(duì)照品溶液在上述22根色譜柱上的色譜圖導(dǎo)入DRS Origin軟件，以7個(gè)成分中任意2種成分在上述22根色譜柱上得到的保留時(shí)間平均值[標(biāo)準(zhǔn)保留時(shí)間（standard retention time，SRT）]為橫坐標(biāo)，以其在每根色譜柱上的實(shí)際保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，得到7個(gè)成分在每根色譜柱上的線(xiàn)性擬合方程，將其他5種成分的SRT代入方程，求得7個(gè)成分在每根色譜柱上的預(yù)測(cè)保留時(shí)間。根據(jù)DRS Origin軟件中各色譜峰保留時(shí)間回歸偏差、預(yù)測(cè)正確率和色譜柱符合率情況，按照雙標(biāo)選擇盡量分布在保留時(shí)間區(qū)域的兩端的原則，同時(shí)兼顧對(duì)照品易得程度，選擇峰2（綠原酸）和峰7（黃芩苷）作為雙標(biāo)化合物。

2.4.3 雙標(biāo)線(xiàn)性校正法的建立 在色譜柱26上采集雙標(biāo)化合物（綠原酸和黃芩苷）色譜峰實(shí)際保留時(shí)間作為縱坐標(biāo)，以二者的SRT為橫坐標(biāo)，得到雙標(biāo)化合物在色譜柱26上的線(xiàn)性擬合方程為y=0.9631x-0.0865，即建立雙標(biāo)線(xiàn)性校正法。

2.4.4 保留時(shí)間的預(yù)測(cè)與結(jié)果驗(yàn)證 將其他5種成分的SRT代入此方程，求得新綠原酸、隱綠原酸、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩帷?,5-O-二咖啡?？鼘幩嵩谏V柱26上的預(yù)測(cè)保留時(shí)間。經(jīng)實(shí)物對(duì)照品驗(yàn)證，5種成分的預(yù)測(cè)保留時(shí)間與實(shí)測(cè)保留時(shí)間的誤差不超過(guò)0.5 min，結(jié)果準(zhǔn)確，見(jiàn)表3?？梢?jiàn)使用DRS Origin軟件建立雙標(biāo)線(xiàn)性校正法，方法簡(jiǎn)便科學(xué)。

表3 色譜柱26上7個(gè)成分的實(shí)測(cè)保留時(shí)間和預(yù)測(cè)保留時(shí)間

2.5 定量研究

2.5.1 典型色譜圖 在色譜柱26上，進(jìn)行上述7個(gè)成分的定量研究，典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品和供試品的HPLC圖譜

2.5.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3, 4-O-二咖啡?？鼘幩?、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩?、4, 5-O-二咖啡?？鼘幩峋?27±2 nm處有最大吸收，而黃芩苷在278±2 nm處有最大吸收，故選擇以327 nm作為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸、3, 5-O-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岬臋z測(cè)波長(zhǎng)，以278 nm作為黃芩苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.5.3 相對(duì)校正因子的計(jì)算 將2.2項(xiàng)下的各對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋250，100，50，25，20，10倍，制成混合對(duì)照品系列稀釋液，精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，依前述色譜條件進(jìn)行分析，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，分別得到其余6種成分的相對(duì)校正因子（f）。

式中，As、Ar分別為待測(cè)組分和參照物的峰面積；Ws、Wr分別為待測(cè)組分和參照物的進(jìn)樣量。根據(jù)公式，求得新綠原酸、隱綠原酸、3, 4-O-二咖啡酰奎寧酸、3, 5-O-二咖啡酰奎寧酸、4, 5-O-二咖啡酰奎寧酸和黃芩苷對(duì)綠原酸的f值分別為0.9606，09612，1.0243，1.2603，1.2394，1.0872。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)7個(gè)對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明各對(duì)照品的保留時(shí)間和峰面積積分值的RSD均小于2.0 %，符合分析要求。

2.5.4.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取2.5.3項(xiàng)下的混合對(duì)照品系列稀釋液和2.2項(xiàng)下黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值。以各對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3, 4-O-二咖啡?？鼘幩帷?, 5-O-二咖啡?？鼘幩帷?, 5-O-二咖啡?？鼘幩岷忘S芩苷進(jìn)樣量分別在18.15～453.70 ng、17.52～437.90 ng、16.50～412.53 ng、17.46～436.61 ng、15.19～379.84 ng、15.45～386.19 ng、17.73～4433.62 ng范圍內(nèi)和峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品1，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份。分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及上述供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，對(duì)7個(gè)成分色譜峰的保留時(shí)間和峰面積積分值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明各對(duì)照品的保留時(shí)間和峰面積積分值的RSD均小于2.0 %，符合分析要求。

2.5.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品1，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，每隔4 h進(jìn)樣一次，每次10 μl，測(cè)定7個(gè)成分的峰面積積分值，共考察24 h，以觀(guān)察供試品溶液在檢測(cè)過(guò)程中待測(cè)成分的穩(wěn)定性。結(jié)果表明各對(duì)照品的保留時(shí)間和峰面積積分值的RSD均小于2.0 %，符合分析要求。

2.5.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已測(cè)知含量的樣品1，精密量取0.5 ml，置50 ml棕色量瓶中，分別精密加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3, 4-O-二咖啡?？鼘幩帷?, 5-O-二咖啡?？鼘幩幔?, 5-O-二咖啡?？鼘幩岷忘S芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.75，1，1，0.5，0.2，1，20 ml，再加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。平行制備6份。分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液及上述供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算含量。新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸，3, 4-O-二咖啡?？鼘幩?，3, 5-O-二咖啡?？鼘幩幔?, 5-O-二咖啡?？鼘幩岷忘S芩苷的平均回收率分別為98.62 %，102.58 %，100.41 %，104.76 %，103.17 %，102.95 %，97.39 %，RSD分別為1.93 %，1.08 %，1.10 %，0.74 %，0.92 %，0.78 %，1.13 %。表明測(cè)定方法的回收率良好。

2.5.4.6 色譜柱耐用性考察 分別考察色譜柱2～20、22、24～25，各成分分離度良好，且各成分與綠原酸的f值的色譜柱間RSD均小于2.0 %。

2.5.5 樣品含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，平行測(cè)定2次，分別采用雙標(biāo)多測(cè)法和外標(biāo)法測(cè)定樣品中7個(gè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。比較兩種方法測(cè)得含量，絕對(duì)偏差（AD）均小于0.1 mg/ml，表明雙標(biāo)多測(cè)法可用于銀黃口服液中7個(gè)成分的含量測(cè)定。

表4 樣品中7個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

本文建立了雙標(biāo)多測(cè)法測(cè)定銀黃口服液中6種咖啡?？鼘幩岷忘S芩苷的含量，以綠原酸和黃芩苷為雙標(biāo)化合物，采用雙標(biāo)線(xiàn)性校正法進(jìn)行色譜峰定性，同時(shí)以雙標(biāo)化合物中的綠原酸作為新綠原酸、隱綠原酸、3, 4-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、4, 5-O-二咖啡?？鼘幩岷忘S芩苷的替代對(duì)照品，采用最大吸收波長(zhǎng)相對(duì)校正因子法對(duì)銀黃口服液進(jìn)行定量研究。有研究表明，檢測(cè)波長(zhǎng)和儀器波長(zhǎng)偏移對(duì)相對(duì)校正因子影響較大[7]，測(cè)定相對(duì)校正因子時(shí)應(yīng)采用各組分最大吸收波長(zhǎng)模式而非單一波長(zhǎng)模式，前者能避免因儀器和環(huán)境因素改變引起的誤差。將雙標(biāo)多測(cè)法與外標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比，兩種方法所測(cè)得結(jié)果絕對(duì)偏差均小于0.1 mg/ml。

中藥品種眾多且成分復(fù)雜，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)大多僅控制單一成分，因此替代對(duì)照品法有著廣闊的應(yīng)用前景。雙標(biāo)多測(cè)法是對(duì)替代對(duì)照品法的一種發(fā)展，提供了一種替代對(duì)照品法研究的新思路，這一方法將大大降低中藥及天然藥物分析檢測(cè)的成本。但作為一種新的應(yīng)用方法，在標(biāo)準(zhǔn)化和實(shí)用化方面，尚需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。