DNA條形碼分子鑒定技術在中藥材鑒定中的應用

王 麗，趙 銳，張秋芳

（淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255000）

我國中藥材資源豐富，有12 000余種，不同地區(qū)用藥差異明顯，導致藥材來源復雜、品種多變，嚴重影響了中藥臨床用藥的療效及穩(wěn)定性。為保證中藥在臨床用藥中安全有效，中藥材的鑒定已成為中藥研究中的重要內(nèi)容。原植物（原動物）鑒定、顯微鑒定、性狀鑒定、理化鑒定等方法是較為常用的中藥材鑒定方法。但這些鑒定技術較易受生長環(huán)境、儲存、加工工藝及鑒定人員的主觀性等方面的影響。DNA條形碼等現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，彌補了傳統(tǒng)鑒定方式準確度低、主觀性較強等缺陷，大大提高了中藥材鑒定的效率及準確性，在中藥材的質量控制方面有非常廣闊的應用前景。

1 常見分子技術及應用現(xiàn)狀

限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析被稱為第一代分子標記技術，是通過分析酶切片段的長度差異來進行基因型差異分析的一種分子生物學手段，其特點是共顯性，能鑒別出純合與雜合基因型，且穩(wěn)定性好、重復性強。該方法的缺點是在鑒定不同物種時需選擇與其相對應的探針，技術難度較大。此項技術在川貝母[1]，天麻[2]，白茅根[3]等植物類中藥材的基原鑒定、資源種類分析方面已有相關研究。隨機擴增多態(tài)DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析屬于指紋圖譜類技術，該技術無需對植物進行任何分子生物學探究，直接通過隨機引物進行擴增，得到多條不同分子量的譜帶，比較樣本間的差異便可做出物種鑒別。該方法的不足之處為穩(wěn)定性不強，重復率不夠高。該方法在竹節(jié)參[4]、廣藿香[5]、黃精[6]等常見的中藥材鑒定中應用較為廣泛。擴增片段長度多態(tài)性（amplication fragment length polymorphism，AFLP）分析是一種結合RFLP和PCR的指紋圖譜技術，其優(yōu)點是無需事先合成引物或設計探針，且由于該技術對引物退火溫度有極高的要求，因此具有高重復性、高分辨率等優(yōu)點，但該技術需要研究者有較高的理論知識和實驗技能，且費用相對較高。近期該技術應用于益智[7]、黨參[8]及粗莖秦艽[9]等中藥材的鑒定和種內(nèi)遺傳多樣性的分析研究工作。微衛(wèi)星即簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）技術和在其基礎上發(fā)展起來的簡單序列重復區(qū)間（inter-simple sequence repeat，ISSR）標記分析可鑒定不同物種、同一物種的不同位點及同一位點不同等位基因之間的差異，可揭示更多的多態(tài)性。研究報道該技術可應用于溫莪術[10]、金銀花[11]、黃芪[12]等植物的藥用研究及資源評價方面。缺點是其操作過程相對復雜，引物通用性較差，針對不同引物、不同材料使用的擴增條件差異較大，需對反應體系及條件反復摸索。

DNA條形碼技術作為新興的分子檢測技術有著其他檢測技術無法比擬的優(yōu)勢。該技術只需選用一個或幾個簡短的基因片段就可對整個屬、科甚至多個科的絕大多數(shù)物種進行鑒定。其操作更易實現(xiàn)自動化，鑒定過程相對于其他分子方法更快速?？衫没ヂ?lián)網(wǎng)等信息平臺對鑒定結果進行全球化統(tǒng)一管理及共享等。

2 DNA條形碼技術在動、植物中藥材鑒定中的應用

2.1 DNA條形碼技術簡述及鑒定流程

DNA條形碼技術是利用生物體內(nèi)能代表該物

種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段來進行物種身份確認的生物技術。DNA條形碼概念在2003年由加拿大動物學家Paul Hebert首次提出，之后受到廣泛關注，利用該技術可進行物種間的快速自動鑒定。此項技術的主要操作及分析流程為：（1）對中藥材進行預處理；（2）DNA提??；（3）PCR擴增；（4）PCR產(chǎn)物檢測與純化；（5）序列測定及質量評估。

2.2 DNA條形碼在植物類中藥材鑒定中的應用

2.2.1 ITS/ITS2序列與植物類中藥材鑒定 內(nèi)部轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列存在于核糖體RNA，為核糖體RNA內(nèi)部轉錄間隔區(qū)序列，該序列種屬特異性明顯，保守性強，易擴增且具有足夠的可變性以區(qū)分密切相關的物種。Kress等[13]選取了10個常見條形碼，通過對7個科相關物種及53個科88個屬99個物種的鑒定，證實了ITS可用于鑒定屬間、種間、居群間等相對低分類等級的系統(tǒng)關系。朱英杰等[14]分別選擇psbA-trnH、葉綠體核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶大亞基（rbcL）、matK、rpoB、rpoC1及核ITS2序列作為DNA條形碼對重樓屬11個物種進行鑒定，發(fā)現(xiàn)ITS2的擴增和測序效率均達100 %。借助ITS2序列能方便快捷地鑒定出大多數(shù)全草類中藥，如大青葉[15]、砂仁[16]、黨參[17]等。

2.2.2psbA-trnH序列與植物類中藥材鑒定psbA-trnH序列是被子植物葉綠體基因psbA與trnH之間的一段非編碼區(qū)，該區(qū)域進化速度快，變異位點多，常用于植物屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育研究。Sun等[18]選擇psbA-trnH序列作為研究對象，對忍冬及其相關物種共44個樣本進行檢測，其成功率高達100 %。有研究表明該條形碼可精準、高效地鑒定枸杞屬植物、薯蕷屬、何首烏等各基原及其近緣物種[19-21]。由于psbA-trnH序列的測序成功率較高，該序列與其他序列組合作為DNA條形碼也能提高植物類藥材鑒定的準確性與時效性。psbA-trnH與trnL-F形成組合序列可有效鑒別黑胡麻與多葉胡麻。psbA-trnH與matK、trnL-F形成組合序列可有效鑒別野菊與藥用野菊。

2.2.3 其他常用序列與植物類中藥材鑒定matK也是葉綠體基因中變化較大、進化速度較快的序列，能在種屬水平上提供更多的進化與發(fā)育信息，單獨或與其他序列組合均適用于植物類中藥材的分子鑒定。劉靜等[22]選擇matK序列作為DNA條形碼，快速、精準地鑒定出了石斛屬12個物種的基原。研究發(fā)現(xiàn)該條形碼在白頭翁、高良姜、雞血藤與其混偽品的鑒定中都發(fā)揮了極大作用[23-25]。matK與psbA-trnH序列在豆蔻科中有顯著的差異，利用兩種條形碼組合對該科10個種的40個樣品進行鑒定，有效率達95 %。rbcL序列同樣屬于葉綠體基因序列，該序列變異信息豐富，也是較為常用的中藥材鑒別條形碼。Newmaster等[26]對GenBank中rbcL序列進行了詳細分析，研究發(fā)現(xiàn)其可鑒定出同屬物種的85 %，當該序列與psbA-trnH序列組合測定時，對43科48屬96種的鑒定效率甚至能達到88 %。國際生命條形碼協(xié)會植物工作組也早已將rbcL和matK序列組合作為植物的條形碼序列。在我國基于rbcL序列的條形碼鑒定也已在浙貝母[27]、陽春砂[28]、紅景天[29]等中藥材鑒定中得到廣泛應用。

2.3 DNA條形碼在動物類中藥材鑒定中的應用

2.3.1 線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（COI）序列與動物類中藥材鑒定COI序列是一段長約650 bp的線粒體基因，該序列極易利用通用引物進行擴增，同時又能保證足夠變異，其序列中幾乎不存在插入和缺失。利用COI序列對金錢百花蛇及其混偽品共4個種11份樣品進行分析，相同的屬能明顯聚集在一起，且各物種又形成相對獨立的支，能與偽品明確區(qū)分開，該方法已被《中國藥典》[30]收載。杜鶴等[31]對鱉甲及其偽品8個種15份樣品的COI序列進行研究，NJ樹顯示，5個正品樣本能明顯地聚集在一起，與偽品區(qū)分度較高。近年，基與COI序列的DNA條形碼，已廣泛應用于熊膽粉[32]、蛤蟆油[33]、鹿茸粉[34]等名貴中藥材的鑒別。

2.3.2 線粒體細胞色素b基因（Cytb）序列與動物類中藥材鑒定Cytb序列屬于線粒體基因，是一段具有豐富系統(tǒng)發(fā)育信息的較短DNA片段，所包含的遺傳信息適用于種間、屬間鑒定。羅暉明等[35]發(fā)現(xiàn)阿膠中驢源性物質的Cytb基因可被酶切成長度為76 bp與314 bp的兩個片段，偽品無此酶切反應，為其質量控制提供了可靠的技術保障。王義權等[36]通過Cytb基因序列研究成功鑒定了金錢白花蛇、烏梢蛇等蛇類中藥材。另外，利用Cytb基因序列也可靈敏、準確、高效地鑒定出燕窩[37]、林蛙油[38]、穿山甲[39]等藥材與營養(yǎng)品中摻偽現(xiàn)象。

2.3.3 rRNA條形碼與動物類中藥材鑒定 rRNA即核糖體RNA，在細胞內(nèi)含量較多，其相對分子質量也較大，能在mRNA的指導下將氨基酸合成肽鏈。現(xiàn)有較多的研究表明，rRNA序列條形碼適用于多種動物類中藥材的鑒定。劉忠權等[40]對中藥材龜甲與其混偽品18個種進行線粒體12SrRNA基因序列測定，成功鑒別出所有偽品。白根本等[41]對11種鹿的鹿血與鹿茸進行特異性PCR擴增，利用通用引物L1091和H1478擴增細胞線粒體12SrRNA基因片段，準確區(qū)分出具有差異的種。12SrRNA基因片段也能快速、高效地鑒定出蛤蟆油[42]、塞隆骨[43]、烏賊[44]等動物類中藥材與其摻偽品。有些動物類中藥材可通過多種條形碼進行鑒別與鑒定，但不同的條形碼之間鑒定的準確性與靈敏度存在一定差異。

3 DNA條形碼等分子鑒定技術在中藥材鑒定中存在的問題

DNA條形碼等分子鑒定技術在中藥材鑒定方面比傳統(tǒng)鑒定方法有明顯的優(yōu)勢，當然也存在一定的局限性。目前，條形碼選擇、DNA提取、序列測定等分子生物學方法在中藥材鑒定方面缺少相關標準，形成分子鑒定技術標準規(guī)范及確定對照序列或條形碼可減少其操作盲目性，也為實驗室之間的數(shù)據(jù)比對提供可靠依據(jù)。雖然現(xiàn)階段在2020年版《中國藥典》中已有對烏梢蛇、蘄蛇、川貝母、金錢白花蛇、霍山石斛的法定DNA分子鑒別方法，但相對于《中國藥典》所列的500多種常用動植物藥材來說數(shù)量還是極少的，仍需尋找特異的DNA分子探針，繼續(xù)完善相關品種的基因序列與條形碼。DNA條形碼等分子技術目前在動植物類藥材真?zhèn)舞b定中發(fā)揮了極大的作用，但從根本上評估中藥材的質量仍有一定難度，如利用該技術很難區(qū)分出中藥材具體用藥部位；對于存儲、運輸條件不當，已發(fā)生霉變、褐變或由于放置時間過長，已出現(xiàn)大量細胞衰亡及DNA降解的中藥材，無法利用以上技術對指定的DNA片段進行擴增，也會大大限制其應用，只能結合傳統(tǒng)方式來對藥材來源及藥用部位進行準確、全面的鑒定。

4 小結

DNA條形碼等分子鑒定技術借助其操作簡單、便捷，結果準確、有效等優(yōu)勢，逐漸被廣泛應用于中藥材鑒定工作中。借助此技術對正品道地產(chǎn)地藥材與非道地藥材進行對比分析，搞清其遺傳結構與分化水平，可為該藥材的鑒別、良種選育、種質資源的利用提供遺傳資料。該技術的引入能在一定程度上緩解鑒定人才缺乏的現(xiàn)狀?？衫媚骋环N藥材的DNA條形碼，并結合該藥材的產(chǎn)區(qū)、種植基地、生長年限、采收年份等信息，按設定的編碼規(guī)則編譯成二維碼。這種方式能提高對中藥材生產(chǎn)及流通管理的有效性，使中藥材質量控制體系不斷完善。