頂空氣相色譜法測定睪酮中的殘留溶劑

侯海波，鄭建雄，李 廿，朱保林

（湖北竹溪人福藥業(yè)有限責任公司，湖北 十堰 442300）

睪酮是由男性的睪丸或女性的卵巢分泌的一種天然雄激素，具有維持肌肉強度及質(zhì)量、維持骨質(zhì)密度及強度、提神及提升體能等作用[1-2]。睪酮能影響多種身體機能及代謝，包括血生成、體內(nèi)鈣平衡、骨礦化作用、脂代謝、糖代謝等，同時睪酮還是合成丙酸睪酮、十一酸睪酮等甾體藥物的重要醫(yī)藥中間體[3-4]。睪酮在生產(chǎn)合成過程中使用的二類有機溶劑有甲醇、吡啶，三類有機溶劑有乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯。本研究按照ICH關(guān)于殘留有機溶劑指導原則的要求[5-6]，建立頂空氣相色譜法測定睪酮中有機溶劑殘留量，并對該分析方法進行驗證[7-8]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 7890B氣相色譜儀（配備FID檢測器，7697A頂空進樣器及OpenLAB CDS工作站，美國Agilent公司）；ME204E型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）。

1.2 試劑

睪酮（湖北竹溪人福藥業(yè)有限責任公司，批號：180601，180602，180603）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，色譜純，Merck公司）；甲醇，乙醇（分析純，國藥集團）；甲酸乙酯，乙酸乙酯，吡啶（分析純，上海凌峰）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624型（30 m×0.53 mm，3.0 μm）毛細管柱；升溫程序：35 ℃保持10 min，然后以6 ℃/min的速率升溫至120 ℃，再以20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min；檢測器溫度250 ℃；進樣口溫度220 ℃；分流比10:1；載氣為氮氣，載氣流速2.0 ml/min；頂空進樣，頂空平衡溫度100 ℃，平衡時間45 min；定量管溫度110 ℃；傳輸線溫度120 ℃；進樣體積1000 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 定位溶液制備 精密稱取甲醇3.0 g，乙醇5.0 g，甲酸乙酯5.0 g，乙酸乙酯5.0 g，吡啶0.2 g，分別置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，搖勻；分別取上述溶液5 ml，置于不同100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，混勻；再分別取上述溶液1.0 ml，置于不同10 ml頂空瓶中，再加DMF2.0 ml，密封，混勻。

2.2.2 對照品貯備溶液制備 精密稱取甲醇3.0 g，乙醇5.0 g，甲酸乙酯5.0 g，乙酸乙酯5.0 g，吡啶0.2 g，置于已有DMF 20 ml的100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，混勻；再移取上述溶液5 ml，置100 ml量瓶中，以DMF稀釋至刻度，混勻。

2.2.3 對照品溶液制備 取對照品貯備溶液1.0 ml于10 ml頂空瓶中，加DMF 2.0 ml，密封，混勻。

2.2.4 供試品溶液制備 精密稱取睪酮0.5 g，置于10 ml頂空瓶中，加入DMF 3 ml，密封。

2.2.5 樣品加標溶液制備 精密稱取睪酮0.5 g，置于10 ml頂空瓶中，加入對照品貯備溶液1.0 ml及DMF 2.0 ml，密封。

2.3 專屬性實驗

取DMF 3.0 ml，置10 ml頂空瓶中，密封，作為空白溶液；取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液、樣品加標溶液，按2.1項下色譜條件分別進樣，結(jié)果表明加入睪酮后沒有其他雜質(zhì)峰出現(xiàn)，睪酮在此體系中穩(wěn)定，不與溶劑反應，見圖1。各溶劑的分離度良好，可滿足實驗要求。見表1。

圖1 專屬性實驗色譜圖

表1 溶劑保留時間及分離度

2.4 重復性

取6份樣品加標溶液，按2.1項下色譜條件分別進樣測定。甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的含量RSD分別為1.25 %，1.51 %，1.78 %，1.92 %，1.52 %。結(jié)果表明，該色譜條件下重復性良好。

2.5 檢測限

信噪比（S/N）約為3時的溶液濃度為各溶劑的檢測限，甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的檢測限分別為1.67，3.67，0.66，0.42，0.04 μg/ml。

2.6 定量限

信噪比（S/N）約為10時的溶液濃度為各溶劑的定量限，甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯和吡啶的定量限分別為5.0，11.2，2.1，1.25，0.13 μg/ml。

2.7 線性試驗

取定量限溶液和0.4，0.8，1.0，1.2 ml對照品溶液各3份，分別置于15個不同頂空瓶中，并加DMF溶液至3 ml，密封，搖勻，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標做線性回歸，得回歸方程，見表2。結(jié)果表明，各溶劑在相應的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 溶劑線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.8 加樣回收試驗

取已知含量的同一批樣品，精密稱取9份，每份0.5 g，置于10 ml頂空瓶中。分為3組，分別加入對照品貯備溶液0.8 ml（80 %濃度水平）、1.0 ml（100 %濃度水平）、1.2 ml（120 %濃度水平），再分別加入DMF溶液2 ml，密封，混勻，計算80 %，100 %及120 %濃度水平下各組分的回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果

2.9 耐用性實驗

取12份樣品加標溶液，平均分為6組，分別在正常條件、載氣流速1.8 ml/min、載氣流速2.2 ml/min、起始柱溫30 ℃、起始柱溫40 ℃和更換不同型號色譜柱[ZB-624型（30 m×0.32 mm，1.8 μm）毛細管色譜柱]條件下進樣，計算各溶劑峰面積的RSD。結(jié)果，更換色譜柱后各溶劑未能檢出，正常條件、載氣流速1.8 ml/min、載氣流速2.2 ml/min、起始柱溫30 ℃、起始柱溫40 ℃條件下甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶峰面積的RSD分別為2.00 %，2.22 %，2.52 %，2.82 %，2.73 %，結(jié)果表明在特定色譜柱條件下耐用性良好。

2.10 樣品測定

取3批樣品（批號：180601，180602，180603）依法測定，結(jié)果見表4。溶劑限度為：甲醇：≤3000 ppm；乙醇：≤5000 ppm；甲酸乙酯：≤5000 ppm；乙酸乙酯：≤5000 ppm；吡啶：≤200 ppm。結(jié)果表明各溶劑殘留量均符合限度要求。

表4 3批樣品中殘留溶劑檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立頂空氣相色譜測定睪酮中甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶殘留溶劑的方法并進行驗證。結(jié)果表明，該分析方法能有效分離甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶，且操作簡便、重復性好、靈敏度高、適用性強、結(jié)果準確，適用于睪酮的殘留溶劑檢測。該方法同樣適用于生產(chǎn)工藝中使用甲醇、乙醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、吡啶的其他甾體原料藥的殘留溶劑的檢測。