比較三種不同固定液對淋巴結冷凍切片染色質量的影響

姜陽陽，成志強，游淑源

淋巴結活檢的主要作用是對惡性腫瘤淋巴轉移進行分級，明確腫瘤轉移的具體范圍，減少不必要的手術及術后并發(fā)癥[1]。術中冷凍切片能在較短時間內獲得淋巴結的病理診斷結果，對手術治療方式和手術范圍具有較高的指導作用，因此越來越受到臨床醫(yī)師的青睞。淋巴結組織由于其細胞豐富，質地較脆，外圍常有脂肪包繞，在日常冷凍切片工作中較難獲取高質量切片。固定是影響冷凍切片質量的主要因素之一[2]，組織固定欠佳直接導致染色質量差，嚴重影響診斷的準確性。本科室采用不同固定液對淋巴結冷凍切片進行HE染色，取得良好的效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年6～8月我院手術室送檢新鮮淋巴結標本，淋巴結直徑均大于0.5 cm，合計30枚，均符合快速病理標本送檢要求。

1.2 試劑及儀器試劑：甲醇，冰醋酸，Harris蘇木精染色液，伊紅(醇溶性)，櫻花OCT包埋劑，無水乙醇，二甲苯，1% 碳酸鋰水溶液，中性樹膠等。A液 ∶甲醇；B液：冰醋酸-甲醇液(冰醋酸 ∶甲醇=5 ∶95)；C液：冰醋酸-95%乙醇液(冰醋酸 ∶95%乙醇=5 ∶95)。儀器：恒溫冷凍切片機(Leica CM1950)，生物顯微鏡(OLYPMUS BX40)。

1.3 方法送檢的新鮮淋巴結組織，規(guī)范取材后行冷凍切片。實驗前將A、B、C液放置在冷凍切片機內，預冷至機箱溫度(-20 ℃)。常規(guī)冷凍切片(5 μm厚)，每例淋巴結連續(xù)做 9張切片，分別浸泡于3種不同固定液中，固定時間分別為 15、30、60 s。待固定完成后，流水沖洗，收集所有切片置于染色架中，流水沖洗20 s后染色。染色步驟：蘇木精染色液60 s，流水沖洗10 s，1%碳酸鋰水溶液返藍5 s，流水沖洗10 s，伊紅溶液10 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 結果判斷所有切片均由本科室兩名副主任醫(yī)師采用雙盲法閱片，從組織結構、細胞核形態(tài)、細胞核染色、細胞質染色和核質對比等5項進行評分，單項總分為10分，無法診斷計為0分。

2 結果

2.1 HE染色本實驗經A液固定15、30 s的切片：鏡下組織結構不清晰，細胞核腫脹，核染色和胞質染色對比度差。本實驗經C液固定15、30 s的切片：鏡下見細胞間隙增大，細胞核輕度縮小，細胞核和細胞質對比度較好。本實驗經B液固定15、30、60 s的三組切片：鏡下組織結構均完整，細胞形態(tài)清晰，核仁清晰可見，細胞核和細胞染色良好。經A液固定60 s的切片和經C液固定60 s的切片：組織結構均清晰，未見細胞腫脹和收縮，核質對比度好(圖1～4)。

2.2 評分本組結果顯示：A液組和C液組平均分隨著固定時間延長而逐漸增加，平均得分：固定60 s>固定 30 s>固定15 s。B液組平均分相對較為穩(wěn)定(表1)。

表1 三種固定液固定不同時間的HE染色評分

2.3 單因素方差分析固定15 s和固定30 s時，固定液影響冷凍切片HE染色質量(P<0.01)，平均分：B液組>C液組>A液組。進一步兩兩比較，B液組和其他兩組評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示冷凍切片在B液中固定15、30 s時染色質量優(yōu)于其他兩種固定液。固定60 s時，方差分析結果表明三種固定液評分差異無統(tǒng)計學意義(P=0.733)，提示固定液不是影響染色評分的因素。進一步兩兩比較，B液與A、C液組評分差異無統(tǒng)計學意義(P=0.918)，A液組與C液組評分差異無統(tǒng)計學意義(P=0.711)，提示固定60 s時，三組切片均獲得良好的染色效果。

圖1 淋巴結：A液(甲醇)固定15 s,組織結構不清，細胞明顯腫脹

3 討論

影響淋巴結冷凍切片的因素較多，如規(guī)范取材、冷凍速度、切片技巧、固定和染色均是影響切片質量的主要因素。淋巴結通常多份標本同時送檢，淋巴組織內摻雜脂肪，制片難度大，切片時間長，診斷難度大，而淋巴結冷凍切片的診斷直接關系手術進度和手術方式。淋巴結內纖維少，細胞豐富，尤其是核質比高的淋巴細胞染色質極為豐富，良好的固定十分重要。優(yōu)質的固定液，不僅能保證組織形態(tài)原有結構的完整功能，還能最大限度減少冷凍切片與石蠟切片在組織細胞形態(tài)上的差異[3]。

本實驗評估淋巴結冷凍切片經3種固定液固定，HE染色均獲得高質量的淋巴結冷凍切片，鏡下表現(xiàn)為組織結構清晰、顏色鮮艷，細胞核呈藍色，細胞質呈不同程度紅色，細胞形態(tài)清晰，細胞核規(guī)則，細胞間隙無明顯增大，核質對比度良好，核仁和染色質清晰。甲醇為沉淀類固定劑，對組織滲透性強，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白[4]。95%乙醇對抗原性保存較好，能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，但核蛋白被沉淀后溶解于水，造成組織收縮。因此，95%乙醇作為單純的固定液不理想[5]。多項研究證實，固定液中添加一定濃度的冰醋酸對細胞破壞小，細胞核、細胞質染色對比鮮明，本實驗也獲得類似的結論。

冷凍切片固定時間不夠主要表現(xiàn)為細胞核腫脹，染色對比度差，組織結構不清晰，細胞收縮等。本次實驗中對比了不同固定時間對淋巴結冷凍切片HE染色質量的影響，獲得高質量的染色切片，甲醇和冰醋酸-95%乙醇液需要固定60 s，而冰醋酸-甲醇液只需固定15 s，明顯優(yōu)于另外兩種固定液。冰醋酸的穿透能力強，能沉淀核蛋白，可較好地保存染色體的結構，冰醋酸加速蛋白質沉淀，尤其核蛋白沉淀，提升細胞核染色質量。冰醋酸-95%乙醇液固定未見核蛋白溶解，切片顯示細胞核和細胞質染色質量較高，短時間固定會引起細胞收縮，但不影響診斷。冰醋酸對組織有膨脹作用，經冰醋酸-95%乙醇液固定60 s，冷凍切片染色質量高，未見明顯細胞間隙，95%乙醇能快速引起細胞收縮，而冰醋酸對組織的膨脹作用較緩慢，95%乙醇的收縮作用與冰醋酸的膨脹作用相抵消需要固定時間，實驗證明在固定60 s時取得較好的效果。

本實驗顯示冰醋酸-甲醇混合液配制簡單，固定時間短，效果好，有利于快速制片，是一種理想的淋巴結冷凍切片固定液。