EBV miRNAs介導(dǎo)T細(xì)胞體內(nèi)免疫的研究進(jìn)展

林夢瑤，張 聲

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬于人類皰疹病毒4型，多數(shù)人易感并表現(xiàn)為無癥狀感染。1964年Epstein和Barr在培養(yǎng)的伯基特淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)EBV，可引起傳染性單核細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等疾病。EBV進(jìn)入人體，最初感染口咽部上皮細(xì)胞，經(jīng)病毒外膜糖蛋白gp350/220與B細(xì)胞表面CD21分子結(jié)合，隨后gp42/gH/gL/gB使病毒潛伏于B淋巴細(xì)胞中[1]。EBV通過病毒復(fù)制持續(xù)存在于感染個(gè)體中，并影響免疫應(yīng)答過程，參與病毒感染的模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptor, PRR)，調(diào)控固有免疫反應(yīng)；在潛伏期和裂解期，抑制病毒蛋白的水平，從而降低免疫識(shí)別能力；利用非編碼RNA如EBER、miRNA等多個(gè)靶點(diǎn)逃避宿主免疫攻擊[2]。

在EBV基因組中，已鑒定出超過80個(gè)編碼蛋白的開放閱讀框(ORFs)以及大約30種不同的ncRNA，位于EBV BHRF1和BART區(qū)域的25個(gè)前體miRNAs編碼至少44種miRNA[3]。 miRNAs改變病毒和宿主基因的表達(dá)，調(diào)控機(jī)體的免疫能力，參與免疫逃逸、細(xì)胞增殖、凋亡和代謝等過程[4]。T細(xì)胞參與機(jī)體免疫自穩(wěn)，識(shí)別抗原并維持記憶和自我耐受，在抗感染和抗腫瘤中起至關(guān)重要的作用[5]，但miRNAs如何影響T細(xì)胞免疫的機(jī)制尚不明確。本文對(duì)近年EBV miRNAs介導(dǎo)T細(xì)胞體內(nèi)免疫的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步探討發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 T細(xì)胞發(fā)育

T細(xì)胞起源于骨髓祖細(xì)胞的造血干細(xì)胞，在皮質(zhì)-髓質(zhì)交界處T細(xì)胞祖細(xì)胞進(jìn)入胸腺，發(fā)育為早期T細(xì)胞祖細(xì)胞，隨后遷移至胸腺皮質(zhì)，形成表達(dá)T細(xì)胞抗原受體(TCR)的CD4、CD8雙陽性胸腺細(xì)胞，經(jīng)歷陽性與陰性選擇后成為成熟T細(xì)胞，隨血液輸送到外周系統(tǒng)[5]。

2 EBV miRNAs調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答

2.1 EBV miRNAs減弱T細(xì)胞特異性識(shí)別抗原的能力EBV進(jìn)入人體后，B細(xì)胞和T細(xì)胞是主要的免疫細(xì)胞，其中抗原提呈細(xì)胞(APC)將病原體抗原遞呈給T細(xì)胞，T細(xì)胞通過免疫突觸及雙重識(shí)別辨認(rèn)病原體抗原，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵組分。CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)溶酶體途徑(MHC Ⅱ類分子途徑，外源性抗原提呈)，APC攝取外源性抗原后，溶酶體降解抗原并與MHC Ⅱ類分子結(jié)合，供CD4+T細(xì)胞識(shí)別。CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)胞質(zhì)溶膠途徑(MHC I類分子途徑，內(nèi)源性抗原提呈)，蛋白酶體降解內(nèi)源性抗原，與MHC I類分子結(jié)合，供CD8+T細(xì)胞識(shí)別。

EBV miRNAs影響CD4+T細(xì)胞的抗原呈遞。miRNAs靶向CD4+T細(xì)胞應(yīng)答中信號(hào)通路病毒產(chǎn)物的表達(dá)，關(guān)鍵調(diào)控物質(zhì)為白介素-12亞基(IL-12B)和溶酶體蛋白酶，如豆類蛋白酶(LGMN：編碼天冬酰胺肽鏈內(nèi)切酶AFP-豆莢蛋白)、組織蛋白酶B(CTSB)和干擾素γ誘導(dǎo)蛋白30(IFI30：編碼IFN調(diào)節(jié)的硫醇還原酶GILT)[6]，減少IL-12、HLA Ⅱ類分子以及溶酶體酶的分泌[7]。熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)miR-BART1、miR-BART2和miR-BHRF1-2通過3′UTRs調(diào)控IFI30、LGMN和CTSB的水平[8]。miRNAs影響CD8+T細(xì)胞識(shí)別抗原，通過降低細(xì)胞表面病毒抗原或腫瘤抗原遞呈的MHC I類分子，協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷[8-9]?？乖庸は嚓P(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP)下調(diào)，抑制抗原肽與MHC分子結(jié)合形成pMHC，阻斷抗原肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸，減弱CD8+T細(xì)胞識(shí)別抗原及免疫應(yīng)答的能力。

此外，EBV miRNAs能夠降低病毒抗原的表達(dá)，間接阻止T細(xì)胞特異性識(shí)別抗原。EBV有6個(gè)核抗原(EBNAs)和3個(gè)潛伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)。如樹突狀細(xì)胞攜帶的LMP2A可以引起特異性免疫應(yīng)答，以誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞依賴性免疫[10]，并影響MHC I類和MHC Ⅱ類分子途徑交叉提呈處理抗原[11]。miR-BHRF1-3靶向IFN介導(dǎo)的趨化因子CXCL-11/I-TAC的表達(dá)，減弱T細(xì)胞識(shí)別抗原的能力[12]。

2.2 EBV miRNAs降低T細(xì)胞活化、增殖與分化的水平T細(xì)胞經(jīng)過活化、增殖和分化后參與機(jī)體免疫應(yīng)答。根據(jù)表面標(biāo)志物可以將T細(xì)胞分為γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞，αβT細(xì)胞由CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞組成；CD4+T細(xì)胞繼續(xù)分化為Th1、Th2、Th9、Th17細(xì)胞等。

雙識(shí)別信號(hào)(抗原識(shí)別、共刺激)和細(xì)胞因子是T細(xì)胞活化的重要途徑，其中細(xì)胞因子是關(guān)鍵因素。如機(jī)體感染使樹突狀細(xì)胞分泌IFNγ和IL-12，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、分化為Th1細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet，隨后產(chǎn)生IFN，促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化；IL-4激活STAT6信號(hào)，誘導(dǎo)T細(xì)胞形成Th2細(xì)胞，并拮抗Th1細(xì)胞分化；GATA-3是主要的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子；IL-17促使T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，參與炎癥反應(yīng)。

EBV miRNAs調(diào)節(jié)細(xì)胞因子影響T細(xì)胞活化、增殖與分化。研究表明，miRNAs參與多個(gè)免疫通路，下調(diào)與CD4+T細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵分子。EBV+細(xì)胞高表達(dá)IL-12水平，支持免疫細(xì)胞信號(hào)的傳遞[13]。在體內(nèi)IL-1β、IL-18和IL-12共同作用生成IFNγ，刺激T細(xì)胞向Th1和Th17分化和免疫應(yīng)答，miR-BHRF1-2-5p阻止IL-1的信號(hào)通路，改變EBV相關(guān)性癌細(xì)胞中IL-1A和IL-1B的含量，間接干擾其他細(xì)胞因子的形成[14]。

2.3 EBV miRNAs阻止T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)初始T細(xì)胞遇到樹突狀細(xì)胞遞呈的抗原和共刺激配體，增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞清除病原體。其中CD8+效應(yīng)T細(xì)胞通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞分化其他亞群進(jìn)行免疫防御[15]，也能分泌細(xì)胞因子促進(jìn)巨噬細(xì)胞的防御能力。清除病原體后，部分效應(yīng)T細(xì)胞形成記憶T細(xì)胞。

CD8+T細(xì)胞經(jīng)過次級(jí)淋巴器官循環(huán)，并通過TCR受體被樹突狀細(xì)胞激活，增殖分化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷壞死和惡性細(xì)胞，防止機(jī)體感染和腫瘤形成[16]。研究發(fā)現(xiàn)，感染KSHV和EBV的B細(xì)胞可以將病毒編碼的miRNA轉(zhuǎn)移至T細(xì)胞，并抑制抗病毒反應(yīng)[17]。記憶CD8+T細(xì)胞是抵抗病原體的主要成分，協(xié)同顆粒酶、穿孔素及細(xì)胞因子(如干擾素IFNγ、腫瘤壞死因子TNFα)介導(dǎo)殺傷效應(yīng)[18]。

3 T細(xì)胞免疫與EBV相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展

3.1 慢性活動(dòng)性EBV感染其是由EBV引起的淋巴組織增殖性疾病，常見于東亞兒童和年輕人，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、肝脾和淋巴結(jié)腫大。實(shí)驗(yàn)室檢查通常無特異性，外周血或受累器官中EBV-DNA水平升高是典型特征[19]。

目前，慢性活動(dòng)性EBV感染發(fā)病機(jī)制尚不清楚，以往研究認(rèn)為其與免疫系統(tǒng)異常和基因缺陷有關(guān)。Toyabe等[20]在慢性活動(dòng)性EBV感染患者外周血中發(fā)現(xiàn)，抗原的免疫反應(yīng)和EBV感染性T細(xì)胞的增殖是導(dǎo)致T細(xì)胞增高的原因。Fujiwara等[21]認(rèn)為EBV感染的T/NK細(xì)胞中，常不表達(dá)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別的免疫蛋白，如EBNA2和EBNA3s。相反，EBV永生化B細(xì)胞表達(dá)所有的潛伏蛋白。因此，EBV感染的T/NK細(xì)胞更易逃避免疫監(jiān)視。此外，Onozawa等[22]研究發(fā)現(xiàn)慢性活動(dòng)性EBV感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中EBV感染的克隆增殖性T/NK細(xì)胞STAT3激活，并且JAK1和JAK2抑制劑魯索替尼(ruxolitinib)抑制STAT3的磷酸化及炎癥反應(yīng)，同時(shí)降低EBV+T/NK細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)。Rodriguez等[23]發(fā)現(xiàn)慢性活動(dòng)性EBV感染者出現(xiàn)PIK3CD和TNFRSF9純合子突變，維持EBV感染T細(xì)胞的積累，TNFRSF9基因突變導(dǎo)致CD137/4-1BB表達(dá)完全缺失，減弱T細(xì)胞表達(dá)的共刺激信號(hào)；編碼PI3K催化亞基p110δ的PIK3CD基因突變，降低激酶活性，減少T細(xì)胞的AKT信號(hào)。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA影響疾病發(fā)展。Kawano等[24]檢測19例慢性活動(dòng)性EBV感染者、14例傳染性單核細(xì)胞增多癥和11例健康對(duì)照組的12個(gè)miRNA血漿表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)慢性活動(dòng)性EBV感染者血漿中特異性EBV miRNAs水平不同程度升高。一些EBV miRNAs，特別是miR-BART2-5p、13和15，是疾病嚴(yán)重程度或預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。Zhang等[25]構(gòu)建EBV編碼miRNAs的綜合表達(dá)譜，結(jié)果顯示慢性活動(dòng)性EBV感染、EB病毒噬血相關(guān)綜合征和鼻咽癌患者中miR-BART19-3p表達(dá)上調(diào)，慢性活動(dòng)性EBV感染樣本中APC mRNA表達(dá)與miR-BART19-3p呈負(fù)相關(guān)。

3.2 傳染性單核細(xì)胞增多癥其是由EBV感染的良性淋巴增生性疾病，常見于兒童和青少年，表現(xiàn)為咽喉疼痛、發(fā)熱、肝脾和淋巴結(jié)腫大。

Kaul等[26]對(duì)CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，在急性感染期，CD8+T細(xì)胞和單核細(xì)胞的關(guān)鍵基因群(I型IRGs、Ⅱ型IRGs、細(xì)胞周期/代謝基因)表達(dá)上調(diào)。Barros等[27]發(fā)現(xiàn)在傳染性單核細(xì)胞增多癥中絕大多數(shù)的EBV+細(xì)胞是B細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞多于CD4+T細(xì)胞，EBER+、PD-L1+細(xì)胞的數(shù)量與EBER+、CD3+和EBER+、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量直接相關(guān)，提示PD-L1是T細(xì)胞感染EBV的機(jī)制。另外，EBV特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)主要針對(duì)溶解蛋白，這些蛋白在感染急性期大量表達(dá)。急性期之后，記憶CD27+T細(xì)胞仍然存在，而效應(yīng)CD27-T細(xì)胞的比例下降，當(dāng)EBV重新感染時(shí)，記憶CD8+T細(xì)胞發(fā)揮最重要的作用[28]。

miRNA是調(diào)控機(jī)體免疫的關(guān)鍵因素。Gao等[29]檢測15例傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒的病毒和細(xì)胞miRNAs水平，發(fā)現(xiàn)早期傳染性單核細(xì)胞增多癥患者EBV-miR-BHRF1-1、1-2-3P,miR-BART13-1、19-3p、11-3P、12-1、16-1明顯高于健康兒童，CD8+T細(xì)胞中hsa-miR-223、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-181a、hsa-miR-200a-3p、miR-155-5p、miR-155-146a、miR-155-142-5p等大部分miRNAs表達(dá)下調(diào)；隨著疾病的進(jìn)展，CD8+T細(xì)胞的大部分miRNAs，包括hsa-let-7a-5p、hsa-let-142-3p、hsa-let-142-5p和hsa-let-155-5p表達(dá)降低。Hu等[30]分析30例傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒和10例健康兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群miR-BART16及其靶蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒血清中miR-BART16表達(dá)明顯高于健康患兒，且與EBV拷貝數(shù)呈正相關(guān)。

3.3 EBV相關(guān)性胃癌其約占胃癌總數(shù)的10%，與EBV非相關(guān)性胃癌相比，EBV相關(guān)性胃癌的患者發(fā)病年齡較低，早期癌癥發(fā)生率高，多見于男性，病變好發(fā)于胃上部或中部，主要累及黏膜下層，鏡下見間質(zhì)有高度浸潤的淋巴細(xì)胞，預(yù)后較好[31]。

EBV相關(guān)性腫瘤中，MHC的下調(diào)或增加PD-L1和吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)的表達(dá)能使T細(xì)胞的監(jiān)視功能失活[32]。EBV相關(guān)性胃癌常表現(xiàn)為ARID1A突變(55%)、BCOR突變(23%)、PIK3CA突變(68%)、DNA高甲基化、JAK2、ERBB2、PD-L1以及PD-L2擴(kuò)增和罕見的TP53突變[33]。Su等[34]通過CRISPR-Cas9技術(shù)形成PD-1缺陷的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，該細(xì)胞可以增強(qiáng)對(duì)EBV-LMP2A抗原的免疫應(yīng)答，并且加大對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，對(duì)EBV相關(guān)性胃癌小鼠放療后，PD-1缺陷型細(xì)胞毒性T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)大幅增加，提示PD-1/PD-L1通路是T細(xì)胞殺傷病原體和腫瘤發(fā)展的重要途徑。Chan等[35]發(fā)現(xiàn)，miR-BART5-5p直接靶向PIAS3的3′UTR，下調(diào)PIAS3蛋白水平、激活STAT3、增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)。Sasaki等[36]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過JAK2、PI3K和mTOR抑制劑處理EBV相關(guān)性胃癌細(xì)胞后，PD-L1的表達(dá)水平降低到與未受IFNγ刺激細(xì)胞相同的水平，EBV相關(guān)性胃癌細(xì)胞表達(dá)高水平的PD-L1抑制T細(xì)胞增殖，IFNγ信號(hào)通路參與PD-L1的表達(dá)。Song等[37]在胃癌組織和細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-BART11可導(dǎo)致叉頭盒蛋白P1(FOXP1)下調(diào)，可能觸發(fā)癌細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、1L-10，導(dǎo)致胃癌患者生存期降低。

3.4 EBV相關(guān)性鼻咽癌鼻咽癌是鼻咽部上皮的惡性腫瘤，EBV感染是其中的危險(xiǎn)因素，表現(xiàn)為鼻塞、涕中帶血、復(fù)視、頭痛，放療效果較好。

MHC I類分子編碼產(chǎn)物可以識(shí)別和遞呈抗原給細(xì)胞毒性T細(xì)胞，MHC I類分子的突變和失活破壞抗原遞呈機(jī)制，使EBV相關(guān)性鼻咽癌細(xì)胞逃離宿主免疫監(jiān)視。EBV核抗原-1(EBNA-1)是機(jī)體感染的免疫識(shí)別位點(diǎn)，F(xiàn)ogg等[38]通過多肽和細(xì)胞因子刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，激活EBNA-1特異性CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)該T細(xì)胞的免疫功能存在缺陷，從而促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。Ye等[39]在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)外泌體miR-24-3p通過抑制FGF11表達(dá)，調(diào)節(jié)ERK和STAT蛋白的磷酸化，從而抑制T細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)控癌細(xì)胞的生長。

4 展望

EBV屬于DNA病毒，主要通過唾液傳播，多數(shù)人易感，可以引起多種疾病。miRNAs是長度為20～24個(gè)核苷酸的小RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。EBV通過miRNA調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，介導(dǎo)T細(xì)胞改變炎癥因子的水平，可能是相關(guān)性疾病治療的潛在靶點(diǎn)。