基于高通量測序的清水竹筍加工關(guān)鍵環(huán)節(jié)細(xì)菌污染狀況分析

戴奕杰，湯嬌嬌，李 珂

(1.貴陽學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550005；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410125）

竹筍廣泛分布于中國長江以南地區(qū)。因其具有的生長季節(jié)性限制，新鮮竹筍并不能得到全年供應(yīng)，而采后迅速木質(zhì)化降低了新鮮竹筍的營養(yǎng)品質(zhì)和適口性。同時，新鮮竹筍會發(fā)生褐變或變黃，尤其集中體現(xiàn)在采收時的切面。采后貯藏措施可以延長竹筍的貨架期，但不能保證竹筍的全年供應(yīng)。為此，對新鮮竹筍進(jìn)行不同的加工處理是必要的，包括發(fā)酵、煮沸、熱燙、罐裝和腌制。其中，罐裝、干燥和發(fā)酵最為常見[1]。竹筍在剝殼、挑選、整形等加工環(huán)節(jié)必然會產(chǎn)生以筍殼、筍頭以及預(yù)煮水等為主的廢棄物，這些廢棄物堆積后若得不到及時處理，微生物生長繁殖加劇，將污染竹筍加工廠周圍環(huán)境。

食源性疾病是指通過攝食而進(jìn)入人體的有毒有害物質(zhì)等致病因子所造成的疾病?？煞譃楦腥拘院椭卸拘裕ǔＲ姷氖澄镏卸?、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲病以及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)所引起的疾病[2]。根據(jù)竹筍加工廠的竹筍預(yù)處理過程，在新鮮竹筍剝殼后極易受到操作者攜帶的病菌污染，隨后進(jìn)行預(yù)煮環(huán)節(jié)[3]，雖經(jīng)過高溫處理，但仍有耐熱致病菌芽孢存在，二次供水的清潔程度也會直接影響竹筍制品安全性，進(jìn)入操作臺后工作人員在挑選、整形過程的不當(dāng)操作也可能導(dǎo)致竹筍制品的安全隱患。

本研究擬對竹筍加工廠二次供水及竹筍分割整形操作臺上竹筍殘?jiān)M(jìn)行采樣，通過菌落總數(shù)測定、16S rDNA擴(kuò)增子測序結(jié)合Tax4Fun功能預(yù)測分析該竹筍加工廠微生物污染情況，重點(diǎn)關(guān)注與人類疾病密切相關(guān)致病菌的相對豐度及基因表達(dá)狀況，為竹筍加工廠食源性疾病的預(yù)防提供理論依據(jù)，并提出相應(yīng)對策建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

竹筍加工廠二次供水以及操作臺上竹筍邊角料等竹筍殘?jiān)汉夏持窆S加工企業(yè)；NaCl（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NovaSeq6000型高通量測序分析儀：美國Illumina公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：美國Axygen Biosciences公司；QuantiFluor?-ST：美國Promega公司；TS-2102C型立式恒溫振蕩器：上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；XK97-A型菌落計(jì)數(shù)器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法對樣本的基因組脫氧核糖核酸（DNA）進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇通用引物 515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴(kuò)增DNA中V3、V4區(qū)域。使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs 公 司 的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

1.3.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；對檢測合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，采用酶標(biāo)定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用荷蘭Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.3.3 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使 用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3.4 菌落總數(shù)測定

菌落總數(shù)測定依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》進(jìn)行。具體步驟：無菌條件下稱取25 mL二次供水以及25 g竹筍殘?jiān)鼧悠酚?25 mL具有適量無菌玻璃珠的生理鹽水中，在恒溫振蕩器（120 r/min）震蕩2 min后，用生理鹽水進(jìn)行稀釋。取10-1和10-2稀釋度樣品各1 mL，分別用（46±1） ℃的滅菌平板計(jì)數(shù)瓊脂15～20 mL傾注平皿，轉(zhuǎn)動混勻，每個稀釋度傾注兩個平皿。待瓊脂凝固后倒置平板，經(jīng)（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后，用放大鏡和菌落計(jì)數(shù)器記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量，菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU）表示，每批次樣品檢測3份。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)

通過對竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)淇倲?shù)檢測，二次供水中檢測到菌落總數(shù)為1.5×102CFU/mL，竹筍殘?jiān)袡z測到的菌落總數(shù)為9.2×103CFU/g，可以發(fā)現(xiàn)竹筍殘?jiān)⑸锟偭扛?，受污染更?yán)重。

2.2 細(xì)菌序列豐度及多樣性分析

如圖1（a）所示，所有樣品曲線形狀相似均趨于平坦，說明6個樣品細(xì)菌組成均勻程度相近。如圖1（b）所示，6個樣品的曲線均趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)足以覆蓋所有的細(xì)菌，表明6個樣品中細(xì)菌具有多樣性。二次供水的Shannon指數(shù)［圖1（c）］和Simpson指數(shù)［圖1（d）］均高于竹筍殘?jiān)?，說明二次供水中的細(xì)菌多樣性高于竹筍殘?jiān)褹CE指數(shù)［圖1（e）］和Chao1［圖1（f）］越高表明二次供水的物種豐富，分配更均勻。

圖1 竹筍殘?jiān)岸喂┧男蛄胸S度及Alpha-多樣性

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

Venn圖可以更加直觀的表現(xiàn)出樣品獨(dú)有和共有的操作單元（OUT）數(shù)目，表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。圖2為竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)蠴TU數(shù)目的重疊情況，重疊OTU數(shù)目為79，占總OTU數(shù)目的56.43%，二次供水和竹筍殘?jiān)?dú)有的OTU數(shù)目分別為40和21，占總OTU數(shù)目的28.57%、15.00%，說明兩個樣本間微生物之間存在一定相似性。

圖2 OUT水平上的Venn圖

主坐標(biāo)分析（PCoA）是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)[4]。本研究基于Weighted Unifrac距離來進(jìn)行PCoA分析，并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示。由圖3可以看出，竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)M內(nèi)三點(diǎn)之間呈現(xiàn)明顯聚集狀態(tài)，說明組內(nèi)菌落結(jié)構(gòu)差異較小；而二次供水與竹筍殘?jiān)鼉蓸悠方M間距離相差較大，說明竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)g菌落結(jié)構(gòu)有一定差異。

圖3 基于Unweighted UniFrac距離的PCoA圖

2.4 物種相對豐度柱狀圖

如圖4所示，竹筍水及竹筍廢棄物中相對豐度排名前15的細(xì)菌為巴黎鏈球菌、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳酸明串珠菌、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、大腸桿菌、棉籽糖乳球菌（Lactococcusraffinolactis）、武侯氏不動桿菌、鯨魏斯氏菌（Weissellaceti）、炭疽芽孢桿菌、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、加納魏氏菌（Weissella ghanensis）、睪酮假單胞菌（Comamonastestosteroni）、熱死索絲菌（Brochothrixthermosphacta）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

圖4 細(xì)菌屬水平、種水平相對豐度柱狀圖

巴黎鏈球菌是一種條件致病菌，可能具有毒力島和致病基因[5]，可通過入侵腸道導(dǎo)致兒童腹瀉。Marmolin等[6]研究了鏈球菌的不同亞種對人類感染性心內(nèi)膜炎和胃腸道疾病之間的可能聯(lián)系，強(qiáng)調(diào)了巴黎鏈球菌導(dǎo)致的菌血癥患者的1年致死率達(dá)到66.7%。此外，診斷為巴黎鏈球菌導(dǎo)致菌血癥的患者中，26.3%患有癌癥，并且這些癌癥中的80%在胃腸系統(tǒng)之外，除非進(jìn)行諸如核磁共振成像或正電子發(fā)射斷層掃描之類的檢查，否則難以診斷。王麗君[7]從乳房發(fā)炎的奶牛乳樣中通過16S rRNA基因克隆測序確定巴黎鏈球菌2株，表明巴黎鏈球菌是潛在導(dǎo)致奶牛乳腺炎的致病菌，這與Chen等[8]對患乳腺炎奶牛分離的巴黎鏈球菌研究相一致。Almuzara等[9]研究表明巴黎鏈球菌可能會促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)侵襲，而隨后侵入宿主細(xì)胞保護(hù)細(xì)菌免受抗菌劑的侵害，并導(dǎo)致慢性感染的發(fā)展。巴黎鏈球菌在二次供水和竹筍殘?jiān)衅骄鄬ωS度分別為0.207和0.554，均占據(jù)首位。

不動桿菌是一類革蘭氏陰性菌[10]，其中某些菌種是條件致病菌。有關(guān)武侯氏不動桿菌研究較少，該菌于2018年被Hu等[11]首次檢測出，其病理學(xué)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步挖掘研究。熱死索絲菌為革蘭氏陽性微需氧無芽孢菌[12]，主要存在于肉制品中，是真空、冷凍包裝肉制品主要腐敗菌之一[13-14]。大腸桿菌是常見病原菌，呈革蘭氏陰性，存在于生物腸道內(nèi)，在一定條件下可以引起人體發(fā)生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染[15]，在竹筍加工廠二次供水中平均相對豐度為0.013 0，居于第6位，在竹筍殘?jiān)衅骄鄬ωS度為0.003 8，居于第8位。炭疽芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，芽孢抗毒性強(qiáng)，可導(dǎo)致家畜、人類患炭疽病。在二次供水及竹筍殘?jiān)衅骄鄬ωS度分別為0.001 8、0.000 5。

2.5 Tax4Fun功能預(yù)測

Tax4Fun功能預(yù)測是通過基于最小16S rRNA序列相似度的最近鄰居法實(shí)現(xiàn)的[16]，其具體做法為提取KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組16S rRNA基因序列并利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）算法將其比對到SILVA SSU Ref NR數(shù)據(jù)庫（BLAST bitscore＞1 500）建立相關(guān)矩陣，將通過UProC和PAUDA兩種方法注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組功能信息對應(yīng)到SILVA數(shù)據(jù)庫中，實(shí)現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫功能注釋。測序樣品以SILVA數(shù)據(jù)庫序列為參考序列聚類出OTU，進(jìn)而獲取功能注釋信息。

如圖5所示，二次供水及竹筍殘?jiān)谢墚愷B(yǎng)型生物及發(fā)酵作用基因表達(dá)平均值較高，化能異養(yǎng)生物可分為腐生型和寄生型[17]，腐生型可從無生命有機(jī)物獲得營養(yǎng)物質(zhì)，會引起食品腐敗變質(zhì)，如毛霉、根霉以及芽胞桿菌[18]等。寄生型生物必須寄生在活的有機(jī)體內(nèi)，從寄主體內(nèi)獲得營養(yǎng)物質(zhì)[19]，能夠引起動植物的微生物病害，如普遍存在的鏈球菌和大腸桿菌。發(fā)酵作用微生物主要以乳球菌、乳桿菌以及明串珠菌占優(yōu)勢，且竹筍殘?jiān)l(fā)酵作用極顯著高于二次供水（P=0.007）。二次供水中表達(dá)量高且顯著高于竹筍殘?jiān)谋磉_(dá)基因是植物病原體（P＜0.001），竹筍殘?jiān)斜磉_(dá)量高且與二次供水具有顯著區(qū)別的基因有人類病原體（P=0.027）以及寄生蟲（P=0.027）。

圖5 KEGG聚類T-Test分析圖

3 結(jié)論與討論

本文針對竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)M(jìn)行菌落總數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)竹筍殘?jiān)芯淇倲?shù)顯著高于二次供水，表明竹筍殘?jiān)芪⑸镂廴緡?yán)重。通過16S rDNA擴(kuò)增子測序分析、Venn圖和PCoA分析表明竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)具有一定的相似性，可能是竹筍殘?jiān)L時間堆放發(fā)酵，微生物快速生長繁殖，導(dǎo)致工廠周圍水資源中的微生物群落結(jié)構(gòu)改變，并趨于一致。物種相對豐度圖中顯示竹筍加工廠二次供水和竹筍殘?jiān)衪op5細(xì)菌為巴黎鏈球菌、乳酸乳球菌、食竇魏斯氏菌、乳酸明串珠菌、發(fā)酵乳桿菌。其中巴黎鏈球菌已經(jīng)被證明可通過食物進(jìn)入人體腸道，入侵宿主細(xì)胞保護(hù)致病菌，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)侵害，誘導(dǎo)腹瀉、痢疾等腸道疾病。本研究發(fā)現(xiàn)巴黎鏈球菌在竹筍殘?jiān)械南鄬ωS度高于二次供水，推測竹筍殘?jiān)前屠桄溓蚓饕獊碓础６喂┧椭窆S殘?jiān)羞€具有其他相對豐度較高的條件致病菌，如武侯氏不動桿菌、熱死索絲菌、大腸桿菌、炭疽芽孢桿菌等均可能通過食物導(dǎo)致人體患腸道、皮膚疾病。進(jìn)一步通過Tax4Fun功能預(yù)測分析二次供水及竹筍殘?jiān)信c致病微生物基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)的功能特性，發(fā)現(xiàn)二次供水及竹筍殘?jiān)谢墚愷B(yǎng)型生物基因表達(dá)量最高，通常以寄生細(xì)菌為主，特別是相對豐度較高的巴黎鏈球菌。二次供水植物病原體基因表達(dá)量顯著高于竹筍殘?jiān)?，而竹筍殘?jiān)腥祟惒≡w及寄生蟲相關(guān)基因表達(dá)量高于二次供水，表明二次供水及竹筍殘?jiān)芯袑θ梭w有害微生物，并且其基因表達(dá)量較高，直接影響竹筍加工制品安全性[20-21]。

顯然，竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)谝欢ǔ潭壬鲜艿街虏∥⑸镂廴?。因此，提高企業(yè)衛(wèi)生安全意識，加強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)管工作，有效控制操作人員衛(wèi)生狀況是十分必要的。

竹筍加工廠二次供水及竹筍殘?jiān)邪l(fā)酵用細(xì)菌相對豐度較高，通過Tax4Fun功能預(yù)測也側(cè)面表明了關(guān)于食品發(fā)酵基因表達(dá)較高，這也為竹筍加工廠提供豐富的微生物資源，可針對二次供水及竹筍殘?jiān)M(jìn)行微生物培養(yǎng)分離鑒定，將分離得到的具有益生性能的細(xì)菌接種于竹筍殘?jiān)?，從而抑制其他腐敗微生物生長繁殖，有效控制微生物污染周圍水資源，再將發(fā)酵后竹筍殘?jiān)苽涑汕噘A飼料等進(jìn)行二次利用[22]。因此，將竹筍殘?jiān)皶r收集并利用乳酸菌發(fā)酵處理，既能夠解決竹筍加工廠水資源微生物污染以及竹筍殘?jiān)瘮“l(fā)臭問題，又能提高竹筍加工廠的經(jīng)濟(jì)效益。與此同時，二氧化氯作為新型消毒劑，在果蔬、水產(chǎn)品、飲品中具有高效安全性[23]。竹筍廠在對二次供水進(jìn)行處理時，可在其中加入0.7 mg/L二氧化氯[24]進(jìn)行殺菌消毒；竹筍整形階段，間隔1 h用二氧化氯水清洗臺面，可以有效控制微生物污染。