胸腔積液游離核酸檢測(cè)在結(jié)核性胸膜炎早期診斷中的價(jià)值

張蕓 李琨 梁清濤 劉子臣 段鴻飛 李雪蓮 郭茹 車南穎 楊新婷

結(jié)核性胸膜炎是結(jié)核分枝桿菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入胸膜腔引起的胸膜炎癥反應(yīng)［1］。結(jié)核性胸膜炎多見于青年男性，最常見的臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、胸疼、咳嗽及活動(dòng)后呼吸困難［2］?！禬S 288—2017 肺結(jié)核診斷》［3］中明確提出胸腔積液查到結(jié)核分枝桿菌或其核酸檢測(cè)陽性是結(jié)核性胸膜炎確診的依據(jù)。由于結(jié)核性胸膜炎胸腔積液含菌量少的特點(diǎn)，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中查到抗酸桿菌的陽性率不足5%，分枝桿菌培養(yǎng)陽性率也僅為30%，而且培養(yǎng)仍需4～8周時(shí)間［4-5］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦診斷結(jié)核病的檢測(cè)方法GeneXpert MTB/RIF陽性率也僅有34%～51%［6-7］。而臨床上常用的生化檢測(cè)指標(biāo)，例如腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）和結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB），雖敏感度較高，但其特異度較差［8-9］。閉式胸膜活檢和內(nèi)科胸腔鏡雖能通過獲取胸膜組織使結(jié)核性胸膜炎診斷率提高至85%以上，但因其為有創(chuàng)檢查，難以在臨床廣泛應(yīng)用［10-11］。因此，臨床迫切需要更靈敏快速的病原學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核性胸膜炎的早期確診。

游離核酸（cell-free DNA，cf-DNA）是存在于生物體液中無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA 片段，可存在于機(jī)體任何體液中［12］。cf-DNA 作為新的生物標(biāo)志物，最早應(yīng)用于產(chǎn)前胎兒排除畸形檢查中。隨后該技術(shù)被廣泛用于自身免疫疾病和腫瘤的治療、預(yù)后、復(fù)發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域［13］。最近研究發(fā)現(xiàn)，血漿cf-DNA也存在引起機(jī)體不同部位感染的多種細(xì)菌、真菌和寄生蟲等病原體基因組DNA 片段，顯示其可能成為診斷感染性疾病的新技術(shù)［14-15］。隨著對(duì)結(jié)核分枝桿菌認(rèn)識(shí)的加深，人們了解到該菌在正常代謝、凋亡或被破壞后可釋放其特異cf-DNA 片段IS6110。IS6110不僅在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中拷貝數(shù)多、降解迅速，而且可通過PCR 技術(shù)被檢測(cè)到［16-17］。因此，筆者推測(cè)通過檢測(cè)胸腔積液結(jié)核分枝桿菌游離核酸（cell-freeMycobacterium tuberculosisDNA test，CF.TB）可能會(huì)更敏感和特異地診斷結(jié)核性胸膜炎。筆者前期在小樣本的臨床試驗(yàn)中證實(shí)了結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中不僅能檢測(cè)到IS6110，而且CF.TB 檢測(cè)可用于結(jié)核性胸膜炎的早期診斷［18］。但此技術(shù)診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度是否優(yōu)于臨床上常用的生化指標(biāo)和傳統(tǒng)核酸擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid amplification test，NAAT）尚缺乏臨床觀察數(shù)據(jù)。筆者擬通過對(duì)2016年7月至2018年12月連續(xù)住院的不明原因胸腔積液患者同時(shí)行胸腔積液CF.TB、RNA 恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT-PCR）、GeneXpert MTB/RIF、ADA 及血T-SPOT.TB 檢測(cè)，評(píng)價(jià)CF.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎早期診斷的價(jià)值，同時(shí)探討CF.TB技術(shù)單獨(dú)或聯(lián)合ADA 對(duì)臨床表現(xiàn)不典型的結(jié)核性胸膜炎早期診斷價(jià)值，為臨床推廣提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

選擇2016年7月至2018年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院連續(xù)住院的216例不明原因胸腔積液患者為研究對(duì)象，其中，男153例，女63例，年齡15～91歲，中位年齡為46歲，1例患者HIV檢測(cè)陽性。納入患者入院時(shí)均進(jìn)行外周血TSPOT.TB檢測(cè)、胸部X線或CT檢查、胸部彩色多普勒超聲檢查及呼吸道（痰或支氣管灌洗液）GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)、BACTEC MGIT 960培養(yǎng)、分枝桿菌羅氏培養(yǎng)。入院后行胸腔穿刺術(shù)或胸腔置管術(shù)，留取胸腔積液，并對(duì)胸腔積液進(jìn)行常規(guī)、生化檢測(cè)、病理學(xué)檢查以及CF.TB、SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)。所有患者至少隨訪12個(gè)月以明確最終的診斷信息。

二、研究方法

1.結(jié)核性胸膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：采用臨床復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)（composite reference standard，CRS）作為參考標(biāo)準(zhǔn)［3］，即指符合Light診斷標(biāo)準(zhǔn)的滲出性胸腔積液，且滿足以下標(biāo)準(zhǔn)之一。（1）胸腔積液或胸膜組織分離出結(jié)核分枝桿菌或其核酸檢測(cè)陽性；（2）胸膜組織病理學(xué)明確找到干酪樣壞死或不典型肉芽腫，伴或不伴抗酸染色陽性且抗結(jié)核治療有效并隨訪至少12個(gè)月；（3）痰或支氣管灌洗液涂片或GeneXpert MTB/RIF陽性或分枝桿菌培養(yǎng)陽性；（4）患者有發(fā)熱、咳嗽、咳痰、乏力、盜汗等結(jié)核中毒癥狀，胸腔積液為滲出性、ADA增高伴有結(jié)核菌素純蛋白衍生物（PPD）皮膚試驗(yàn)中度以上陽性或抗結(jié)核抗體陽性或血T-SPOT.TB檢測(cè)陽性，經(jīng)臨床醫(yī)生判斷為結(jié)核性胸膜炎且抗結(jié)核治療有效并隨訪至少12個(gè)月。

2.其他病因胸腔積液：（1）惡性胸腔積液：胸腔積液或胸膜組織中檢測(cè)到惡性腫瘤細(xì)胞；（2）其他病因所致胸腔積液：有明確病因的胸腔積液且未接受抗結(jié)核治療并至少隨訪12個(gè)月。

3.分組：根據(jù)患者最終診斷結(jié)果將患者分為結(jié)核性胸膜炎組和非結(jié)核性胸膜炎組。非結(jié)核性胸膜炎組包括惡性胸腔積液、感染性胸腔積液和其他病因胸腔積液（胞內(nèi)分枝桿菌感染、結(jié)節(jié)病、結(jié)締組織病、梅格斯綜合征）。

4.胸腔積液實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)與方法：（1）CF.TB檢測(cè)：①樣本準(zhǔn)備：采集40 ml胸腔積液，通過4℃3000×g離心10 min留取上清液5 ml，再通過4℃16 000×g離心10 min，留取上清液，用于游離核酸提??；②游離核酸提?。喊凑沼坞x核酸提取試劑盒（Qiagen Hilden，Germany）的要求按步驟進(jìn)行操作提取胸腔積液cf-DNA；③檢測(cè)：使用結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（廣州達(dá)安生物工程股份有限公司）檢測(cè)上清液中結(jié)核分枝桿菌目的基因片段IS6110，然后進(jìn)行定量分析。（2）SAT-PCR 檢測(cè)：采集5 ml胸腔積液經(jīng)3000×g離心10 min留取細(xì)胞沉淀，然后按1∶100的比例用稀釋液進(jìn)行稀釋，采用實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒（上海仁度生物科技有限公司）的要求按步驟進(jìn)行操作。（3）GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)：50 ml胸腔積液經(jīng)3000×g離心10 min棄上清，保留沉渣。向沉渣中加入2 ml標(biāo)本處理液振蕩均勻后轉(zhuǎn)入有螺旋蓋的無菌管中，室溫放置15 min。然后取2 ml液化標(biāo)本至GeneXpert MTB/RIF反應(yīng)試劑盒，并將其置于GeneXpert檢測(cè)儀器（美國Cepheid公司）中，2 h內(nèi)儀器自動(dòng)完成檢測(cè)。（4）T-SPOT.TB 檢測(cè)：按照T-SPOT.TB試劑盒（英國牛津Immunotec公司）說明書進(jìn)行操作。以斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot forming cells，SFC）計(jì)數(shù)，我院臨床所用參考值為早期分泌抗原靶蛋白6（early secreted antigenic target of 6 kDa，ESAT-6）或培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）任一個(gè)≥24 SFC/106即為T-SPOT.TB陽性。（5）BACTEC MGIT 960培養(yǎng)：取10 ml胸腔積液經(jīng)3000×g離心10 min后棄上清，保留沉渣。沉渣經(jīng)標(biāo)本處理液處理后取0.5 ml放于BACTEC MGIT 960全自動(dòng)快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀（美國BD 公司）中培養(yǎng)42 d，儀器報(bào)告陽性后，取培養(yǎng)液進(jìn)行涂片鏡檢，若發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌則為陽性，若未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌則為陰性。（6）分枝桿菌羅氏培養(yǎng)：取10 ml胸腔積液經(jīng)3000×g離心10 min后，保留沉渣。沉渣經(jīng)前標(biāo)本處理液處理后，取0.1 ml按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［19］制定的菌株分離培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè)和報(bào)告。

5.結(jié)核性胸膜炎患者亞組分組方法：典型結(jié)核性胸膜炎患者常具有青年男性、合并肺結(jié)核、胸腔積液ADA≥40 U/L 等臨床特點(diǎn)［20］。這些臨床特點(diǎn)常是診斷結(jié)核性胸膜炎的重要參考指標(biāo)。因而，缺乏上述臨床特點(diǎn)的不典型結(jié)核性胸膜炎患者常診斷困難。亞組分組方法：（1）根據(jù)患者年齡分為青年組（15～39歲）、中年組（40～59歲）和老年組（≥60歲）；按是否合并肺結(jié)核分為肺結(jié)核組和無肺結(jié)核組；按呼吸道病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果分為陽性組、無痰或陰性組；按ADA結(jié)果分為ADA≥40 U/L組和ADA＜40 U/L組；按性別分為男性組和女性組；（2）按照臨床特點(diǎn)分為典型結(jié)核性胸膜炎患者和非典型結(jié)核性胸膜炎患者。典型胸膜炎患者臨床特點(diǎn)包括以下之一：①年齡為中青年；②合并肺結(jié)核；③呼吸道病原學(xué)陽性；④ADA≥40 U/L；⑤男性。非典型胸膜炎患者臨床特點(diǎn)包括以下之一：①年齡為老年；②無肺結(jié)核；③呼吸道病原學(xué)陰性；④ADA＜40 U/L；⑤女性。

6.胸腔鏡檢查：術(shù)前患者均進(jìn)行胸部CT、彩色多普勒超聲檢查，明確患者胸腔積液量和膈肌位置。術(shù)中患者一般選擇健側(cè)臥位，患側(cè)腋中線與第5～8肋間交叉點(diǎn)為合適的進(jìn)鏡點(diǎn)。常規(guī)消毒麻醉，切開皮膚1～2 cm，逐層皮下鈍性分離肌肉進(jìn)入胸腔，插入LTF240胸腔鏡（日本Olympus公司），吸出胸腔積液，然后對(duì)壁層胸膜行多點(diǎn)活檢。操作結(jié)束后退出胸腔鏡并放置閉式引流管，縫合切口。觀察患者生命體征。最后將胸膜標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)計(jì)量資料符合正態(tài)分布者以“”描述，偏態(tài)資料采用“中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（Q1，Q3）］”描述。兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，中位數(shù)的比較采用秩和檢驗(yàn)。亞組之間樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、研究對(duì)象一般資料

216例患者中165例臨床確診為結(jié)核性胸膜炎，其中胸腔積液MGIT 960 培養(yǎng)陽性25 例（15.15%，25/165），痰或BALF GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)陽性49例（29.70%，49/165），經(jīng)胸膜活檢確診21例（12.73%，21/165），其他70例（42.42%，70/165）無病原學(xué)證據(jù)。51例確診為非結(jié)核性胸膜炎患者，其中惡性胸腔積液39 例（76.47%），包括腺癌20例、惡性間皮瘤14例、淋巴瘤2例、鱗癌1例、胸腺瘤1 例、前列腺癌1 例；感染性胸腔積液8 例（15.69%），其他原因4例，包括胞內(nèi)分枝桿菌感染、結(jié)節(jié)病、結(jié)締組織病、梅格斯綜合征各1例。

二、結(jié)核性胸膜炎組和非結(jié)核性胸膜炎組患者的臨床資料

結(jié)核性胸膜炎組患者中位年齡（40歲）明顯低于非結(jié)核性胸膜炎組（58歲），而且男性患者明顯多于非結(jié)核性胸膜炎組，其男性患者占76.36%（126/165）。結(jié)核性胸膜炎組患者血清T-SPOT.TB陽性率（87.27%）明顯高于非結(jié)核性胸膜炎患者（37.25%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 兩組患者臨床資料

三、胸腔積液CF.TB、SAT-PCR和GeneXpert MTB/RIF 3種分子生物學(xué)檢測(cè)方法在結(jié)核性胸膜炎中診斷效能的評(píng)價(jià)

以CRS 為參考標(biāo)準(zhǔn)，比較CF.TB、SAT-PCR和GeneXpert MTB/RIF 3 種檢測(cè)方法的診斷效能。胸腔積液CF.TB、SAT-PCR 和GeneXpert MTB/RIF方法診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度分別為70.30%（116/165）、7.88%（13/165）和12.12%（20/165）。CF.TB檢測(cè)敏感度明顯高于SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.350、1.153，P值均=0.000），而且CF.TB 敏感度也明顯高于分枝桿菌培養(yǎng)（15.15%，25/165），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.012，P=0.000）；SATPCR的敏感度略低于GeneXpert MTB/RIF，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.650，P=0.199）（表2）。3種診斷方法檢測(cè)敏感度進(jìn)行交叉比較，結(jié)果顯示12例患者SAT-PCR 檢測(cè)和CF.TB 檢測(cè)同時(shí)陽性，19例患者GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)和CF.TB檢測(cè)同時(shí)陽性。

表2 以CRS為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)三種檢測(cè)方法的診斷效能

四、胸腔積液CF.TB與ADA、T-SPOT.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值

以CRS 為參考標(biāo)準(zhǔn)，比較CF.TB、ADA、T-SPOT.TB的診斷效能。胸腔積液CF.TB、ADA和血T-SPOT.TB方法診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度分別為70.30%（116/165）、67.27%（111/165）和87.27%（144/165）。CF.TB檢測(cè)敏感度明顯高于ADA，但低于T-SPOT.TB，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.025、1.264，P值均=0.000）。CF.TB 與ADA兩種方法聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸膜炎診斷的敏感度為88.48%（146/165），其敏感度明顯高于CF.TB單獨(dú)檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.670，P=0.000）（表3）。

表3 以CRS為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)CF.TB和ADA方法的診斷效能

五、胸腔積液CF.TB對(duì)不典型結(jié)核性胸膜炎患者的診斷價(jià)值

CF.TB、SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF方法對(duì)結(jié)核性胸膜炎患者年齡、性別、是否合并肺結(jié)核、呼吸道病原學(xué)及ADA 各亞組的敏感度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示這三種檢測(cè)方法在各亞組中檢測(cè)敏感度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但CF.TB在不典型結(jié)核性胸膜炎患者各亞組中均有較高的敏感度，在不合并肺結(jié)核組、無痰或呼吸道病原學(xué)陰性組、胸腔積液ADA＜40 U/L 組、中年及老年組陽性率分別為61.02%（36/59）、68.97%（80/116）、64.81%（35/54）、70.83%（34/48）及61.11%（22/36），提示CF.TB檢測(cè)對(duì)臨床不典型結(jié)核性胸膜炎患者的早期診斷有較高價(jià)值（表4）。

表4 三種檢測(cè)方法在結(jié)核性胸膜炎各亞組中的診斷價(jià)值

續(xù)表4

六、胸腔積液CF.TB檢測(cè)降低有創(chuàng)檢查

21例結(jié)核性胸膜炎患者是通過內(nèi)科胸腔鏡或胸膜活檢檢查而確診。21 例患者中15 例患者（71.43%）胸腔積液CF.TB檢測(cè)陽性。

討 論

結(jié)核性胸膜炎是結(jié)核分枝桿菌侵犯胸膜引起的胸膜IV型變態(tài)反應(yīng)，是我國胸腔積液最常見的原因［1］。但因結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中含菌量低，目前臨床常用NAAT檢測(cè)方法很難在胸腔積液中找到病原學(xué)證據(jù)，達(dá)到早期診斷結(jié)核性胸膜炎的目的，亟需尋找新的分子生物學(xué)診斷方法。CF.TB是近年出現(xiàn)的一種新型分子生物學(xué)診斷方法［16-17］。本研究通過納入216例不明原因胸腔積液患者，分析了CF.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以CRS為參考標(biāo)準(zhǔn)，胸腔積液CF.TB診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度（70.30%）明顯高于SAT-PCR（7.88%）、GeneXpert MTB/RIF（12.12%）及ADA（67.27%），而且該方法能降低臨床胸腔鏡或胸膜活檢等有創(chuàng)檢查的使用。

cf-DNA是由凋亡或壞死細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的小分子DNA 片段，可存在于人類血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液及各種體液［12］。cf-DNA 檢測(cè)目前在孕婦產(chǎn)前診斷、腫瘤檢測(cè)、器官移植術(shù)后排斥和感染檢測(cè)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［13-15］。CF.TB是通過檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異性cf-DNA 而建立的一種新的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法［18］。該技術(shù)靶基因是結(jié)核分枝桿菌特異性插入序列IS6110，該片段在結(jié)核分枝桿菌中不僅拷貝數(shù)多，而且降解迅速，不同于傳統(tǒng)NAAT檢測(cè)方法（例如GeneXpert MTB/RIF和SAT-PCR）。GeneXpert MTB/RIF是一種可在2 h內(nèi)完成結(jié)核分枝桿菌基因和利福平耐藥檢測(cè)的全自動(dòng)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，其檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌靶基因是基于利福平耐藥基因決定區(qū)rpoB基因［21］。SAT-PCR技術(shù)是新一代恒溫RNA 擴(kuò)增技術(shù)，其是以結(jié)核分枝桿菌特異16S rRNA 為靶基因［22］。CF.TB作為一種新的診斷方法，在肺結(jié)核及肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值尚不清楚。Yu等［23］研究CF.TB在肺結(jié)核和肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值，顯示以CRS為參考標(biāo)準(zhǔn)，其診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核的敏感度分別為78%和65%，而且血漿CF.TB敏感度高于非血漿（胸腔積液、腦脊液、腹腔積液），提示CF.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎可能具有較好診斷價(jià)值。由于結(jié)核性胸膜炎是結(jié)核分枝桿菌直接感染胸膜或其代謝物進(jìn)入機(jī)體胸膜腔而引起胸膜的局部免疫反應(yīng)［1］，胸腔積液CF.TB 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌陽性率應(yīng)高于血液。為此，本研究比較了胸腔積液CF.TB方法與傳統(tǒng)NAAT方法在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示以CRS為參考標(biāo)準(zhǔn)，CF.TB方法診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度（70.30%）遠(yuǎn)高于SAT-PCR 技術(shù)（7.88%）和GeneXpert MTB/RIF技術(shù)（12.12%）。CF.TB較上述傳統(tǒng)NAAT方法敏感度高的原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）傳統(tǒng)NAAT 檢測(cè)靶基因是結(jié)核分枝桿菌基因組DNA，而CF.TB檢測(cè)是結(jié)核分枝桿菌插入序列片段IS6110。結(jié)核性胸膜炎患者胸腔內(nèi)結(jié)核分枝桿菌含量較低，TB-DNA 不容易檢測(cè)，而IS6110 拷貝數(shù)卻較高，容易檢測(cè)。Yang等［24］研究顯示CF.TB方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的最低下限為1.25 CFU/μl，而以往文獻(xiàn)研究報(bào)道GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌最低濃度為112.6 CFU/ml［7，21］，說明CF.TB檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌下限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)NAAT 方法；（2）cf-DNA穩(wěn)定性較基因組DNA 差。研究表明胎兒cf-DNA 1～2 d內(nèi)就從母體血漿和尿液里被清除，而各種病原體cf-DNA當(dāng)被治療后也能很快被機(jī)體清除，說明cf-DNA能反映機(jī)體最近的感染狀態(tài)［25-26］。這些結(jié)果提示CF.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎具有較好的診斷價(jià)值。

CF.TB作為一種新的分子生物學(xué)方法，其操作方法較傳統(tǒng)NAAT相對(duì)簡(jiǎn)單，而且價(jià)格也僅為傳統(tǒng)NAAT的一半。對(duì)于病原學(xué)診斷困難的結(jié)核性胸膜炎患者，CF.TB可能成為其輔助診斷的方法。為此，筆者將CF.TB、GeneXpert MTB/RIF和SATPCR這3種方法在結(jié)核性胸膜炎中的診斷效能進(jìn)行交叉分析比較，結(jié)果顯示12例患者SAT-PCR檢測(cè)和CF.TB檢測(cè)同時(shí)陽性，19例患者GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)和CF.TB檢測(cè)同時(shí)陽性。這些結(jié)果提示CF.TB 可作為結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷方法。

胸腔積液ADA 和血T-SPOT.TB是臨床上診斷結(jié)核性胸膜炎常用的生物學(xué)標(biāo)志物［8-9，27］。本研究比較了CF.TB和ADA、T-SPOT.TB檢測(cè)在結(jié)核性胸膜炎中診斷價(jià)值，結(jié)果顯示CF.TB診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度（70.30%）高于ADA（67.27%），低于T-SPOT.TB（87.27%），但其特異度（100.00%）明顯高于ADA（92.16%）和TSPOT.TB（62.75%）。若將CF.TB和ADA 兩者聯(lián)合，可明顯提高其診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度（88.48%）。ADA對(duì)結(jié)核性胸膜炎診斷的特異度差的原因可能因?yàn)锳DA是一種與機(jī)體免疫細(xì)胞活性有重要關(guān)系的嘌呤核苷代謝酶。胸腔積液ADA 升高可見于多種疾?。ɡ缃Y(jié)核性胸膜炎、膿胸、肺癌、淋巴瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等）。本研究中有4例非結(jié)核性胸膜炎患者ADA＞40 U/L。而T-SPOT.TB特異度差可能與我國是結(jié)核分枝桿菌潛伏感染高危區(qū)有關(guān)。本研究中有37.25%（19/51）非結(jié)核性胸膜炎患者T-SPOT.TB陽性。這些結(jié)果提示CF.TB對(duì)結(jié)核性胸膜炎較ADA 有更好的診斷價(jià)值，CF.TB與ADA聯(lián)合檢測(cè)可大幅度提高結(jié)核性胸膜炎的早期診斷，CF-TB不受結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的影響。

典型結(jié)核性胸膜炎患者結(jié)合臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查可獲得臨床診斷。但對(duì)于臨床表現(xiàn)不典型、胸腔積液ADA達(dá)不到診斷界值、痰或呼吸道病原學(xué)陰性等不典型結(jié)核性胸膜炎患者很難達(dá)到臨床診斷。本研究165例結(jié)核性胸膜炎患者中，僅有57.58%（95/165）患者通過痰、BALF、胸腔積液或胸膜組織獲得病原學(xué)證據(jù)，其他42.42%（70/165）患者仍需結(jié)合其他輔助方法和診斷性抗結(jié)核治療等結(jié)果進(jìn)行臨床診斷。因此，本研究回顧性分析CF.TB對(duì)上述不典型結(jié)核性胸膜炎患者的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，CF.TB方法對(duì)不典型結(jié)核性胸膜炎患者診斷陽性率也高達(dá)60%～70%。而且在需行內(nèi)科胸腔鏡檢查才確診的結(jié)核性胸膜炎患者中，有71.43%（15/21）的患者CF.TB檢測(cè)陽性。這些結(jié)果提示CF.TB在臨床應(yīng)用中具有廣泛適用性，可有效減少臨床有創(chuàng)檢查。本研究還存在不足之處：本研究為單中心診斷試驗(yàn)，而且研究中心為結(jié)核病專科醫(yī)院，可能導(dǎo)致結(jié)果有局限性，還需大樣本多中心臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，胸腔積液CF.TB檢測(cè)是一種新的靈敏、特異、快速、簡(jiǎn)便的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，其診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度優(yōu)于傳統(tǒng)NAAT方法，可推薦用于病原學(xué)獲得困難的患者（如肺外結(jié)核、胸膜炎、兒童/年老體弱無法取痰者等）的輔助診斷，而且CF.TB與ADA 聯(lián)合能有效提高結(jié)核性胸膜炎的早期診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)張蕓、李琨、梁清濤：數(shù)據(jù)的采集與分析，論文撰寫和修改；劉子臣：標(biāo)本的檢測(cè)；段鴻飛、李雪蓮、郭茹：標(biāo)本收集；車南穎、楊新婷：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施實(shí)驗(yàn)、論文修改及研究經(jīng)費(fèi)支持