冬凌草甲素抗結(jié)核病理損傷的作用機制研究

李銀虹 劉芳琳 鹿振輝 姜昕

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）侵襲人體后，主要定居于巨噬細(xì)胞，固有免疫應(yīng)答對于宿主抵抗MTB感染至關(guān)重要。NOD 樣受體家族蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是目前研究最廣泛、機制了解相對透徹的炎癥小體，其在調(diào)節(jié)固有免疫和炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可活化NLRP3炎癥小體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，影響炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是ERS與NLRP3炎癥小體活化之間的關(guān)鍵聯(lián)系［1-3］。ERS 可通過TXNIP 活化NLRP3炎癥小體介導(dǎo)白細(xì)胞介素（IL）-1β分泌［4］。ERS也可通過核因子κB（NF-κB）誘導(dǎo)IL-1β前體（pro-IL-1β）表達(dá)，并通過TXNIP促進IL-1β 分泌［5］?；诖耍瑢ふ铱梢愿深A(yù)ERS/TXNIP/NLRP3炎癥小體信號通路的藥物成為目前研究炎癥性疾病治療的一個新靶點。

近年來，宿主導(dǎo)向療法（host-directed therapies，HDT）成為結(jié)核病防治的新型策略。HDT 可通過調(diào)節(jié)宿主免疫功能來加強機體抗結(jié)核作用，同時減輕過度炎癥導(dǎo)致的組織損傷，達(dá)到既清除MTB又避免機體損傷的目的。HDT 可以與世界衛(wèi)生組織推薦的直接督導(dǎo)短程化療（directly observed treatment short-course，DOTS）聯(lián)用，降低過度炎癥反應(yīng)引起的肺損傷、縮短疾病病程、降低耐藥性的發(fā)生［6-7］。

我國中草藥資源豐富，從中尋找有效中藥成分，通過調(diào)控宿主免疫功能、增強宿主細(xì)胞的抗菌機制以清除MTB、治療或減輕結(jié)核病癥狀成為目前結(jié)核病防治的研究熱點。中藥冬凌草制劑冬凌草片為臨床非處方藥，廣泛用于抗炎治療［8］。冬凌草甲素（Oridonin）是從中提取的貝殼烯二萜類天然有機化合物，占冬凌草有效成分的90%以上，為無色針狀結(jié)晶，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能［9］。He等［10］研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素通過共價鍵直接結(jié)合NLRP3，抑制NLRP3炎癥小體活化，發(fā)揮抗炎功能。這提示冬凌草甲素及其類似物可作為治療NLRP3相關(guān)疾病，尤其是慢性疾病的潛在治療藥物。曾慶鐘等［11］發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素通過調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮組織ERS從而緩解小鼠結(jié)腸炎癥。冬凌草甲素在MTB感染中的作用，還未見相關(guān)報道，因此，筆者探討冬凌草甲素在MTB感染的巨噬細(xì)胞中的抗炎機制，以期為冬凌草制劑的臨床作用機制提供相關(guān)實驗實依據(jù)。

材料和方法

一、材料及試劑

MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Ra、小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7保存于本實驗室。冬凌草甲素購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自以色列BI 公司；Middle Brook 7H9、7H10培養(yǎng)基購自美國BD 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒，以及蛋白質(zhì)裂解液（RIPA）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠NLRP3、免疫球蛋白結(jié)合蛋白（Bip）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、真核生物翻譯起始因子2α（peIF2α）、磷酸化肌醇需要酶1α（pIRE1α）、肌醇需要酶1α（IRE1α）、pp65、磷酸化應(yīng)激活化蛋白激酶（pJNK）及pp38單克隆抗體購自美國CST 公司，TXNIP單克隆抗體購自美國SC公司，pIRE1α單克隆抗體購自美國NOVUS公司，小鼠抗肌動蛋白單克隆抗體購自美國Proteintech公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自美國CST公司。

二、方法

1.Raw264.7細(xì)胞的培養(yǎng)：Raw264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，放置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.冬凌草甲素對Raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性實驗：冬凌草甲素用二甲基亞砜（DMSO）溶解制備成100 mmol/L的藥物儲液，Raw264.7細(xì)胞生長至對數(shù)期，收集后鋪板于96孔板中，細(xì)胞濃度為2×104/孔，加入不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L）的冬凌草甲素，并設(shè)空白組、DMSO 對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔。放置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，避光加入MTT，10μl/孔，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值（A490值），根據(jù)各孔平均值，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞存活率（%）=（A490值-A空白組值）/（ADMSO組值-A空白組值）×100%。

3.MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Ra的培養(yǎng)：H37Ra菌株用含有10%白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶（albumin dextrose catalase，ADC）營養(yǎng)添加劑的Middle Brook 7H9液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)生長至對數(shù)期。

4.H37Ra 菌株感染巨噬細(xì)胞模型的建立：Raw264.7細(xì)胞離心收集后，鋪板于6孔板中，細(xì)胞濃度為1×106/孔，設(shè)空白組、模型組、藥物處理組，每組3個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。收集生長至對數(shù)期的MTB，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍，按感染復(fù)數(shù)（MOI，即細(xì)菌∶細(xì)胞=10∶1）加入模型組、藥物處理組，共孵育4 h后，PBS洗3遍，以便棄掉未進入胞內(nèi)的MTB；而后細(xì)胞分別采用不同濃度的冬凌草甲素干預(yù)不同的時間，模型組用PBS處理。

5.蛋白免疫印跡法檢測Raw264.7細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)水平：以冬凌草甲素（4.0μmol/L）分別處理模型組細(xì)胞6、12、24 h。預(yù)冷PBS洗3遍后，加入預(yù)冷的RIPA 細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min。4℃、離心半徑10 cm，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清。BCA法檢測蛋白濃度，然后將蛋白與上樣緩沖液（loading buffer）混合后煮沸。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上分離蛋白并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉2.5 h后，將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至預(yù)先按1∶1000進行稀釋好的兔抗NLRP3、Bip、CHOP、peIF2α、pIRE1α/IRE1α、pp65、pJNK及pp38單克隆抗體，以及鼠抗TXNIP單克隆抗體、小鼠抗肌動蛋白單克隆抗體中，4℃搖床孵育過夜。次日Tris-吐溫緩沖液（Tris-buffered saline Tween，TBST）洗3次，每次10 min，然后將膜放入1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗中，室溫孵育1 h，TBST 洗3次。用增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影劑在Protein Sample儀器上進行顯影，用Image J軟件進行圖像的蛋白灰度值測定。

三、制圖與統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以“”描述，組間差異的比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用Turkey’s檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、冬凌草甲素對Raw264.7細(xì)胞活力的影響

在不同時間點（24、48、72 h）用MTT法檢測不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L）冬凌草甲素處理后細(xì)胞的存活情況。結(jié)果顯示，冬凌草甲素作用24 h、48 h和72 h細(xì)胞的存活率均能保持在90%左右，4.0μmol/L 的冬凌草甲素處理細(xì)胞72 h后，Raw264.7細(xì)胞的生存率仍能達(dá)到（101.60±0.61）%，見表1。為此，后續(xù)實驗選擇4.0μmol/L不存在細(xì)胞毒性，為最大藥物安全使用濃度。

表1 不同濃度冬凌草甲素作用下Raw264.7細(xì)胞的生存情況

二、冬凌草甲素抑制MTB 感染的Raw264.7細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化

利用蛋白免疫印跡法檢測NLRP3炎癥小體活化情況，以小鼠肌動蛋白為內(nèi)參。與模型組相比，冬凌草甲素（4.0μmol/L）作用（6、12、24 h）可明顯抑制MTB感染的Raw264.7細(xì)胞NLRP3和TXNIP蛋白的表達(dá)，見表2。

表2 冬凌草甲素作用MTB感染的Raw264.7細(xì)胞不同時間對NLRP3炎癥小體活化的影響

三、冬凌草甲素抑制MTB 感染的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

利用蛋白免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（Bip、CHOP、peIF2α、IRE1α及pIRE1α）的表達(dá)情況，以小鼠肌動蛋白為內(nèi)參。與模型組相比，冬凌草甲素（4.0μmol/L）作用（6、12、24 h）可明顯抑制MTB感染的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，見表3。

表3 冬凌草甲素作用MTB感染的Raw264.7細(xì)胞不同時間對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

四、冬凌草甲素抑制MTB 感染的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α通路下游蛋白的表達(dá)

利用蛋白免疫印跡法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況。以小鼠肌動蛋白為內(nèi)參，與模型組相比，冬凌草甲素（4.0μmol/L）作用（6、12、24 h）可明顯抑制MTB感染的Raw264.7 細(xì)胞IRE1α 通路下游相關(guān)蛋白（pp65、pJNK、pp38）的表達(dá)，見表4。

表4 冬凌草甲素作用MTB感染的Raw264.7細(xì)胞不同時間對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α通路下游相關(guān)蛋白的影響

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色鏈球菌、枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌有明顯的抗菌作用［12］。冬凌草甲素可通過減少一氧化氮、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6釋放緩解炎癥反應(yīng)，同時抑制DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶NF-κB結(jié)合，從而減輕脂多糖對大鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的刺激作用［13］。然而結(jié)核病模型中，還未見有關(guān)冬凌草甲素的相關(guān)報道。

本次實驗首先通過MTT法檢測冬凌草甲素對Raw274.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在4.0μmol/L濃度以下作用24、48、72 h時細(xì)胞的存活率均在90%以上，可見冬凌草甲素在4.0μmol/L濃度下對細(xì)胞的毒性較小，因此，本次實驗選用4.0μmol/L作為冬凌草甲素的最大安全使用濃度。

MTB感染巨噬細(xì)胞可以活化NLRP3炎癥小體，介導(dǎo)成熟IL-1β的釋放［14-16］。多種信號可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，其中，TXNIP與NLRP3的結(jié)合在NLRP3炎癥小體組裝及活化中發(fā)揮重要作用［17］。當(dāng)細(xì)胞受到危險信號如尿酸晶體等刺激后，原本與硫氧還蛋白結(jié)合的TXNIP與之分離，并與NLRP3直接結(jié)合，活化NLRP3炎癥小體［18］。相關(guān)實驗研究發(fā)現(xiàn)，干擾TXNIP蛋白表達(dá)可在一定程度上阻斷NLRP3炎癥小體活化，從而影響下游成熟IL-1β的釋放［19］。本次研究通過冬凌草甲素干預(yù)MTB感染的Raw264.7巨噬細(xì)胞，蛋白免疫印跡法檢測提示MTB感染后，NLRP3及TXNIP蛋白表達(dá)均明顯升高，冬凌草甲素作用6、12及24 h后，可明顯抑制NLRP3及TXNIP蛋白的表達(dá)，TXNIP與NLRP3結(jié)合減少，從而抑制NLRP3炎癥小體活化。那么炎癥小體活化是通過何種機制調(diào)控的？筆者又做了進一步研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)后可通過IRE1α和PERK 促進TXNIP 轉(zhuǎn)錄，抑制TXNIP mRNA降解，活化NLRP3炎癥小體［20］。本次研究通過蛋白免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可明顯抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白Bip和CHOP［21］的表達(dá)水平，同時，明顯抑制與Bip 解離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白pIRE1α、IRE1α及peIF2α的表達(dá)，提示冬凌草甲素可明顯抑制MTB感染誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，解離的IRE1α可形成IRE1/TRAF2/ASK1復(fù)合物，誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中的JNK 和p38MAPK 下游活化。MAPK/NF-κB信號傳導(dǎo)通路是炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路，抑制該信號的傳導(dǎo)可緩解炎癥反應(yīng)［22］。蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果提示，冬凌草甲素明顯抑制MTB感染的Raw264.7細(xì)胞中IRE1α通路下游蛋白pJNK、pp38、pp65表達(dá)水平。基于以上研究結(jié)果，冬凌草甲素在MTB感染巨噬細(xì)胞中可能通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，干預(yù)TXNIP/NLRP3 信號通路，從而抑制NLRP3炎癥小體活化，發(fā)揮抗炎癥損傷的作用。

綜上所述，基于本研究的結(jié)果，筆者推測，冬凌草甲素有可能成為新的HDT 候選藥，作為輔助用藥與臨床一線抗結(jié)核藥物聯(lián)合用于結(jié)核病的防治。另外，本實驗尚存在一些不足之處，例如：細(xì)胞模型相對單一、未開展動物體內(nèi)實驗驗證等，需在后續(xù)工作中進一步完善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻李銀虹：直接參與（實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)）、文章撰寫（起草文章）、工作支持（統(tǒng)計分析）；劉芳琳：直接參與（實施研究、采集數(shù)據(jù)）；鹿振輝：直接參與（分析/解釋數(shù)據(jù)）、文章撰寫（對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱）、工作支持（支持性貢獻）；姜昕：直接參與（醞釀和設(shè)計實驗、分析/解釋數(shù)據(jù)）、文章撰寫（對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱）、工作支持（獲取研究經(jīng)費、指導(dǎo)、支持性貢獻）