河陰突尼斯軟籽石榴花青素的提取工藝研究

馬川蘭，李 會

（河南工業(yè)大學 漯河工學院，河南 漯河 462000）

石榴（Punica granatum L）本名安石榴，屬于落葉喬木或灌木［1］7。根據籽粒的軟硬口感分為軟籽、半軟籽和硬籽石榴三類。軟籽石榴種核特軟，受到人們的重視和喜愛。在眾多的軟籽石榴中，河南省滎陽石榴基地的河陰突尼斯軟籽品種果實美觀早熟，籽粒色澤鮮艷，尤其果核特軟，加上人們對石榴營養(yǎng)價值和保健功能的重視，徹底改變了中國消費者對石榴果品的認知。它含有豐富的膳食纖維和維生素C，還含有花青素、植物性黃酮、多酚類物質、有機酸等生理活性成分。

花青素（anthocyanin）具有抗氧化、抗癌、降血脂、抗衰老、減肥、抑菌、抗疲勞、改善白內障等效果［2-7］。Ana Cristina Miranda Senna Gouvea［8］利用HPLC法測得石榴汁中含有六種花青素，朱峰［9］發(fā)現石榴中花青素較高的是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷和飛燕草素-3，5-葡萄糖苷。而河陰突尼斯軟籽石榴中花青素的含量情況鮮有報道。本研究利用檸檬酸-乙醇法提取河陰突尼斯軟籽石榴中的花青素，通過單因素實驗和正交實驗進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝，為其作為原料應用于保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河陰突尼斯軟籽石榴：網購。

95%乙醇：洛陽市化學試劑廠。

檸檬酸≥99.5%：天津市科密歐化學試劑有限公司。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品≥98%：成都植標化純生物技術。

無水乙醇≥99.7%：開封市鐵塔試劑廠。

濃鹽酸：開封市芳晶化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

HH-8 數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

FA2004型電子天平：上海上平儀器有限公司。

202 型電熱恒溫干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

UV-2600紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

HR1876 飛利浦榨汁機：飛利浦電子香港有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

將石榴粒放入榨汁機中處理，得到石榴汁；將果渣用紗布進行過濾，得到石榴汁。用3 層紗布再次過濾，得到石榴汁原液，并倒入廣口瓶內，放置在冰箱內，冷藏保存。

1.3.2 標準曲線的繪制

準確稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品10 mg（精確到0.001 g），置于50 mL 容量瓶中，用0.8%鹽酸-乙醇溶液定容，配置成濃度為200 μg/mL的標準溶液。

利用移液管分別準確吸取0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL標準溶液于10 mL容量瓶，用鹽酸-乙醇混合溶液定容至刻度，濃度分別為4.0 μg/mL、8.0 μg/mL、12.0 μg/mL、16.0 μg/mL、20.0 μg/mL、24.0 μg/mL。測定波長在520 nm 處的吸光值，準確記錄數據，并繪制標準曲線。

1.3.3 單因素實驗設計

以10%檸檬酸-80%乙醇為提取劑，考察提取溫度、浸提時間、酸醇比、料液比對花青素提取含量的影響。

（1）提取溫度的確定

用移液管準確移取5 份2.0 ml 石榴果汁，并稱量樣品質量。確定浸提時間為2 h，料液比為1∶20，10%檸檬酸/80%乙醇為5∶5，提取溫度分別處于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，并進行浸提、冷卻、離心、測定吸光度。

（2）浸提時間的確定

用移液管準確移取7 份2.0 ml 的石榴果汁，并稱量樣品的質量。確定提取溫度為40℃，料液比為1∶20，10%檸檬酸/80%乙醇為5∶5，浸提時間分別處于30 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，并進行浸提、冷卻、離心、測定吸光度。

（3）酸醇比的確定

用移液管準確移取7 份2.0 ml 的石榴果汁，并稱量樣品質量。確定提取溫度為40℃，浸提時間為2 h，料液比為1∶20，10%檸檬酸/80%乙醇分別處于2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，并進行浸提、冷卻、離心、測定吸光度。

（4）料液比的確定

用移液管準確移取5 份2.0 ml 的石榴果汁，并稱量樣品質量。確定提取溫度為40℃，浸提時間為2 h，10%檸檬酸/80%乙醇為5∶5，料液比分別處于1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，并進行浸提、冷卻、離心、測定吸光度。

1.3.4 正交試驗設計

建立正交試驗因素水平表，探究A提取溫度、B浸提時間、C酸醇比、D料液比4個提取因素對石榴花青素含量的影響，L9（34）正交試驗因素水平表見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 花青素含量計算公式的建立

2.1.1 標準曲線

根據1.3.2方法繪制標準曲線（見圖1），得到標準曲線為y=0.0505x+0.0342，R2=0.9982。結果表明，標準品的濃度與吸光度具有良好的線性關系，并且由7 次測定的數據可得到RSD=0.002964（2%），可判斷儀器精密度可靠。因此，對于同一原料，利用相同的提取方法、同樣的儀器測定吸光度的實驗，其重復性較好。

圖1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準曲線

2.1.2 花青素含量的計算

花青素含量計算公式如下：

其中，C 為吸光度下對應的質量濃度（μg/mL）；V 為樣品浸提液的總體積（mL）；M為所使用的石榴汁對應的質量（g）。

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 提取溫度對花青素含量的影響

花青素對溫度極其敏感。由圖2 可知，隨著溫度的升高，經過提取得到的花青素含量逐漸升高；40℃時，其花青素含量最高；超過40℃時，花青素含量逐漸降低。

圖2 提取溫度對花青素含量的影響

2.2.2 浸提時間對花青素含量的影響

浸提時間不同會影響花青素的溶出率。由圖3可知，隨著浸提時間的加長，花青素含量逐漸增高；花青素含量在浸提時間為2.5 h時達到最高；當浸提時間超過2.5 h時，花青素含量呈現下降趨勢。浸提時間為30 min 的花青素含量大于1 h 的花青素含量，可能是時間過短，從而導致花青素未完全溶出。但是，兩者之間的花青素含量不具有顯著性差異（P>0.05）。

圖3 浸提時間對花青素含量的影響

2.2.3 酸醇比對花青素含量的影響

花青素的顏色會隨著酸堿度的不同而發(fā)生顯著的變化。在酸性條件下，一般呈現紅色，結構比較穩(wěn)定；在堿性條件下，花青素的結構不穩(wěn)定。所選的不同酸醇比的混合溶劑PH 酸堿度都在2-3 范圍內。但是，隨著酸含量的增加，其提取出的花青素出現了上升的趨勢。由圖4可知，隨著酸醇比的變大，花青素含量逐漸升高；當酸醇比處于7∶3時，花青素含量最高；當酸醇比高于7∶3時，花青素含量變小。

圖4 酸醇比對花青素含量的影響

2.2.4 料液比對花青素含量的影響

花青素在溶劑中的溶解度是有限的，溶質與溶劑的比例不同時，會影響花青素的溶出量，間接影響吸光度值。由圖5可知，隨著料液比的縮?。ㄌ崛w積增加），花青素含量逐漸升高；當料液比處于1∶20時，花青素含量最高；當料液比小于1∶20時，花青素含量逐漸變小。

圖5 料液比對花青素含量的影響

2.3 正交試驗

正交試驗結果和方差分析結果見表2和表3。

由表2知，因素影響的主次因素為酸醇比>提取溫度>料液比>浸提時間。由表3知，提取溫度、酸醇比和料液比對實驗結果有顯著性影響，最優(yōu)水平的選擇應該根據K值來判斷，即A2C3D1；而浸提時間的改變對實驗結果不具有顯著性影響，從經濟的角度考慮，選B1。因此，試驗優(yōu)組合為A2B1C3D1。此組合不包括在9組試驗中，應該進行驗證。

表2 L9（34）正交試驗結果

表3 方差分析表

2.4 驗證試驗

用移液管準確移取2 份2.0 ml 的石榴汁，并稱量樣品質量。按照正交試驗后得到的最優(yōu)提取條件提取軟籽石榴中的花青素，并將最優(yōu)提取條件的花青素含量和正交試驗中的最佳進行平行比較，判斷最佳提取條件。

由表4 可知，將正交實驗中的最佳組合與推算出來的最佳水平的結果進行比較，發(fā)現A2B1C3D1的提取條件下得到的花青素含量更高；同時，經方差分析發(fā)現，兩者實驗結果間不具有顯著性差異，這可能與提取溫度、浸提時間的交互作用有關。另外，從經濟角度考慮，提取時間為1.5 h，能夠節(jié)省電能的消耗，節(jié)約成本。綜上所述，可判斷最優(yōu)提取條件應該為提取溫度為40℃，浸提時間為1.5 h，酸醇比為8∶2，料液比為1∶10。

表4 驗證實驗結果分析

3 結論

正交試驗結果表明，考察因素對花青素提取含量的主次因素為酸醇比>提取溫度>料液比>浸提時間。其中，提取溫度、酸醇比和料液比對實驗結果有極顯著性影響（P0.01），浸提時間對實驗結果沒有顯著性影響。

本試驗以河陰突尼斯軟籽石榴作為實驗對象，利用10%檸檬酸-80%乙醇混合溶劑作為提取劑，通過檸檬酸-乙醇法提取石榴汁中花青素，得到最佳提取條件為浸提時間為1.5 h，提取溫度為40℃，料液比為1∶10，酸醇比為8∶2，最終得到的花青素含量為133.81±3.68 μg/g。