右美托咪定調(diào)控circ_0072995對(duì)直腸癌細(xì)胞SW480增殖凋亡的研究

王冰，呂艷玲

寶雞市人民醫(yī)院麻醉科，陜西 寶雞 721000

直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)仍是其最主要治療方式，隨著新輔助放化療、靶向治療、免疫治療等綜合治療手段的發(fā)展，直腸癌患者的術(shù)后生活質(zhì)量和預(yù)后得到改善[1-2]。研究表明，麻醉藥也是影響腫瘤患者預(yù)后的因素之一[3]。鹽酸右美托咪定為腎上腺素受體激動(dòng)劑，常用于麻醉時(shí)輔助鎮(zhèn)靜。有研究報(bào)道右美托咪定可改善機(jī)體免疫功能，減輕直腸癌患者行腹腔鏡手術(shù)時(shí)圍術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)[4]。右美托咪定可顯著降低腹腔鏡直腸癌根治術(shù)患者的血清炎性因子水平，提高患者的肺功能，促進(jìn)臨床療效[5]。此外，右美托咪定還有抗腫瘤作用，如右美托咪定通過miR-760/HDGF 信號(hào)通路減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。右美托咪定還可通過上調(diào)miR-196a-5p表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞侵襲和遷移[7]。然而右美托咪定對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。

有研究表明circRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)，在腫瘤早篩查腫瘤治療等領(lǐng)域具有巨大潛力[8]，circ_0072995 在乳腺癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，沉默_0072995可抑制乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)[9]，circ_0072995通過調(diào)節(jié)miR-147a/CDK6 軸促進(jìn)上皮性卵巢癌的進(jìn)展[10]。然而circ_0072995 對(duì)直腸癌的影響以及右美托咪定對(duì)其影響尚不清楚。因此，本研究主要探討右美托咪定是否可通過調(diào)節(jié)circ_0072995表達(dá)而影響直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 臨床材料 選取寶雞市人民醫(yī)院2017 年1月至2021年1月收治的88例直腸癌患者的癌組織及癌旁組織標(biāo)本，手術(shù)前未進(jìn)行放化療，所有患者均知情且同意。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 SW480 細(xì)胞(美國(guó)ATCC)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；Trizol試劑、熒光定量PCR 試劑盒(大連寶生物)；右美托咪定(深圳海思安生物技術(shù)有限公司)；MTT 試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶)。si-circ_0072995、si-NC、pcDNA-circ_0072995和pcDNA載體質(zhì)粒(廣州銳博生物公司)。

1.3 細(xì)胞處理與分組 將1 mg 右美托咪定用210 mL 的0.9%氯化鈉溶液稀釋至濃度為10 μmol/L，然后再將10 μmol/L的右美托咪定分別用培養(yǎng)液稀釋成濃度為1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L，然后處理SW480細(xì)胞，記為Dex 1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 組，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基中的SW480 細(xì)胞記為con組；將circ_0072995 干擾表達(dá)載體及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SW480 細(xì)胞，記為 si-circ_0072995 組、si-NC 組；將circ_0072995過表達(dá)載體及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞后用5 μmol/L 右美托咪定處理，記為Dex+pcDNA-circ_0072995 組 、Dex+pcDNA 組 。 其 中 si-circ_0072995 序列為：5'-ACCTCAATCGCCGGG-3'，si-NC序列為：5'-TGGAGTTAGCGGCCC-3'。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè)circ_0072995 的表達(dá)水平 提取組織及各組細(xì)胞的總RNA，合成cDNA 后進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-ccCt法計(jì)算。以GAPDH為內(nèi)參，circ_0072995上游引物序列：5'-CAGGCCAGAGGAAAGAACAG-3'，下游引物序列：5'-CAGCGCCCCATCTCATAGCCA-3'；GAPDH上游引物序列：5'-GCACCGTCAAGCTGAGAAC-3'，下游引物序列：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后通過MTT測(cè)定評(píng)估細(xì)胞增殖抑制率。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成數(shù) 將各組細(xì)胞以每孔100 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)2 周，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后用預(yù)冷的 PBS 漂洗 2 次，與 500 μL 的結(jié)合緩沖液混勻；加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0072995在直腸癌患者中的表達(dá)及其與臨床病理關(guān)系 腸癌組織中circ_0072995表達(dá)水平為2.36±0.15，明顯高于癌旁組織的1.00±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1；circ_0072995表達(dá)水平與患者年齡無關(guān)，與TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表1。

圖1 直腸癌組織中circ_0072995表達(dá)水平

表1 circ_0072995的表達(dá)與臨床病理關(guān)系(例)

2.2 右美托咪定對(duì)SW480 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與con 組比較，右美托咪定1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L組SW480 細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少，呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、圖3和表2。

表2 右美托咪定對(duì)SW480細(xì)胞增殖、凋亡的影響(，n=9)

表2 右美托咪定對(duì)SW480細(xì)胞增殖、凋亡的影響(，n=9)

注：與con 組比較，aP<0.05；與Dex 1 μmol/L 組比較，bP<0.05；與 Dex 2 μmol/L 組比較，cP<0.05。

組別Con組Dex 1 μmol/L組Dex 2 μmol/L組Dex 5 μmol/L組F值P值抑制率(%)0.00±0.00 16.73±1.38a 29.96±2.62ab 46.14±3.71abc 613.278<0.05凋亡率(%)7.84±0.50 14.95±0.75a 19.38±1.19ab 22.16±3.78abc 85.026<0.05克隆形成數(shù)(個(gè))119.56±7.32 93.56±4.19a 73.00±3.94ab 51.33±2.87abc 321.653<0.05

圖2 右美托咪定對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

圖3 右美托咪定對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成的影響

2.3 右美托咪定對(duì)SW480 細(xì)胞中circ_0072995表達(dá)的影響 與con 組比較，右美托咪定1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L 組 SW480 細(xì)胞中 circ_0072995 表達(dá)水平降低，呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 右美托咪定對(duì)SW480 細(xì)胞中circ_0072995 表達(dá)水平的影響(，n=9)

表3 右美托咪定對(duì)SW480 細(xì)胞中circ_0072995 表達(dá)水平的影響(，n=9)

注：與 con 組比較，aP<0.05；與 Dex 1 μmol/L 組比較，bP<0.05；與 Dex 2 μmol/L 組比較，cP<0.05。

組別Con組Dex 1 μmol/L組Dex 2 μmol/L組Dex 5 μmol/L組F值P值circ_0072995 1.00±0.00 0.74±0.05a 0.47±0.03ab 0.23±0.02abc 1 024.615<0.05

2.4 沉默circ_0072995 對(duì)SW480 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-circ_0072995 組circ_0072995 表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、圖5和表4。

圖4 沉默circ_0072995對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

圖5 沉默circ_0072995對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成的影響

表4 沉默circ_0072995 對(duì)SW480 細(xì)胞中circ_0072995 表達(dá)、增殖和凋亡的影響(，n=9)

表4 沉默circ_0072995 對(duì)SW480 細(xì)胞中circ_0072995 表達(dá)、增殖和凋亡的影響(，n=9)

組s別i-NC組si-circ_0072995組t值P值circ_0072995 1.00±0.00 0.28±0.03 72.000<0.05抑制率(%)0.00±0.00 36.76±2.02 54.594<0.05凋亡率(%)7.91±0.61 20.41±1.21 27.674<0.05克隆形成數(shù)(個(gè))117.00±8.41 63.78±2.39 18.261<0.05

2.5 circ_0072995 對(duì)右美托咪定處理的SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與Dex+pcDNA 組比較，Dex+pcDNA-circ_0072995 組 circ_0072995 表 達(dá) 水 平升高，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率降低，克隆形成數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6、圖7 和表5。

圖6 circ_0072995對(duì)右美托咪定處理的SW480細(xì)胞凋亡的影響

圖7 circ_0072995對(duì)右美托咪定處理的SW480細(xì)胞克隆形成的影響

表5 circ_0072995減弱右美托咪定對(duì)SW480細(xì)胞circ_0072995表達(dá)、增殖、凋亡的作用(，n=9)

表5 circ_0072995減弱右美托咪定對(duì)SW480細(xì)胞circ_0072995表達(dá)、增殖、凋亡的作用(，n=9)

組別Dex+pcDNA組Dex+pcDNA-circ_0072995組t值P值circ_0072995 1.00±0.00 3.57±0.15 51.400<0.05抑制率(%)46.23±3.27 13.75±0.81 28.033<0.05凋亡率(%)22.07±1.35 10.13±0.81 22.752<0.05克隆形成數(shù)(個(gè))49.89±3.14 104.22±5.12 27.137<0.05

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，麻醉藥能影響患者免疫系統(tǒng)功能和腫瘤細(xì)胞的活性，從而影響腫瘤的進(jìn)展[11-12]。研究報(bào)道右美托咪定通過miR-143-3p/EPS8 軸抑制食管癌的進(jìn)展[13]。右美托咪定可以通過上調(diào)miR-185表達(dá)和滅活SOX9/Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來抑制卵巢癌的發(fā)展[14]。右美托咪定通過下調(diào)miR-1307 表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為[15]。以上研究均表明臨床常用麻醉藥右美托咪定可參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。為研究右美托咪定對(duì)直腸癌的影響，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度右美托咪定處理SW480 細(xì)胞，結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少，呈濃度依賴性；表明右美托咪定可抑制SW480 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示右美托咪定在直腸癌中可能也起抑癌作用。

研究報(bào)道circ_0072995 通過miR-30c-2-3p 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[16]。circ_0072995 通過調(diào)節(jié)miR-122-5p/SLC1A5 軸促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展[17]。敲低circ_0072995 可通過調(diào)控miR-1253/EIF4A3 信號(hào)抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸癌組織中circ_0072995 表達(dá)水平升高，且circ_0072995表達(dá)水平與TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示circ_0072995 可能在直腸癌中起促癌基因作用，且影響患者的病理分期及轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步沉默circ_0072995 后，SW480細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高，克隆形成數(shù)減少；表明沉默circ_0072995 可抑制SW480 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為研究直腸癌中右美托咪定與circ_0072995 的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了右美托咪定處理后SW480 細(xì)胞中circ_0072995 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，circ_0072995 的表達(dá)水平降低，表明右美托咪定可抑制circ_0072995 的表達(dá)；而circ_0072995過表達(dá)的同時(shí)用右美托咪定處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率降低，克隆形成數(shù)增加，表明circ_0072995過表達(dá)可減弱右美托咪定對(duì)SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

綜上所述，右美托咪定可能通過下調(diào)circ_0072995抑制直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。