ROS與膿毒癥NLRP3活化的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制

韓雪妹 綜述 王日興 審校

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科，海南 ?？?570311

機(jī)體防御外來侵害的首要防線是固有免疫，炎性反應(yīng)是最早的固有免疫反應(yīng)之一，它能對(duì)抗進(jìn)入人體引起疾病的外來微生物。大多數(shù)外來微生物在其細(xì)胞壁或細(xì)胞表面表達(dá)各種病原體相關(guān)分子模式(pathogen related molecular patterns，PAMP)，此外，機(jī)體在受刺激時(shí)，細(xì)胞可釋放稱為危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger related molecular patterns，DAMP)的危險(xiǎn)信號(hào)，以識(shí)別緊急情況并通知免疫系統(tǒng)。PAMP和DAMP被固有免疫模式識(shí)別受體(pattern recogniition receptor，PRR)識(shí)別，從而引起一系列的免疫反應(yīng)。炎癥反應(yīng)的發(fā)生不僅需要各種吞噬細(xì)胞通過PRR 識(shí)別PAMPs 和DAMPs，還需要細(xì)胞分泌多種促炎細(xì)胞因子，觸發(fā)下游炎性反應(yīng)途徑，以消除微生物感染并修復(fù)受損的組織。然而，機(jī)體內(nèi)過度的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致膿毒癥，膿毒癥為宿主對(duì)感染所引起的免疫反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]，早期由于缺乏治療經(jīng)驗(yàn)，膿毒癥患者的病死率極高，在開展“拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)”后，膿毒癥的治療方案也更為規(guī)范化，在加強(qiáng)抗感染、液體復(fù)蘇、器官支持等綜合治療后[2]，膿毒癥患者的病情得到好轉(zhuǎn)，早期死亡率大大降低。不幸的是，盡管目前對(duì)膿毒癥的理解及治療有了極大地提高，但是與膿毒癥相關(guān)的疾病的死亡率未能明顯降低[3]。2020 年，一項(xiàng)關(guān)于我國(guó)重癥醫(yī)學(xué)科住院患者的研究表明，膿毒癥的發(fā)病率為20.6%，病死率為35.5%，其中嚴(yán)重膿毒癥病死率高達(dá)50%及以上[4]。雖然膿毒癥患者病死率很高，但是目前尚無(wú)可針對(duì)性藥物用于臨床治療。

炎性體是一種蛋白復(fù)合物，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起著重要作用[5]。炎性體的組成主要包括模式識(shí)別受體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和半胱氨酸蛋白酶1[6]。其中組成炎性體的模式識(shí)別受體最常見的是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)，也稱為 NOD 樣受體(NOD like receotors，NLRs)。炎性體被激活后可促進(jìn)各種炎性因子的釋放，從而參與炎癥反應(yīng)。其中NLRP3炎性體與膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系最密切[7]，目前對(duì)其研究也最為深入。

1 NLRP3炎性體

NLRP3 炎性體是存在于胞質(zhì)內(nèi)的多種蛋白復(fù)合體，下面將分別介紹其組成蛋白。(1)核心蛋白核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣蛋白3(nucleotide-binding oligomerisation domain-like protein 3，NLRP3)：主要由三部分構(gòu)成，包括氨基末端的嘧啶結(jié)構(gòu)域(pyrimidine domain,PYD)、中心核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide bingding and oligomerization domain，NOD)和碳端富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(leucine rich repeat，LRR)。NLRP3 的嘧啶結(jié)構(gòu)域與ASC 的嘧啶結(jié)構(gòu)域相互作用，引發(fā)炎性體組裝。正常情況下，NOD 結(jié)構(gòu)域與LRR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合并處于抑制狀態(tài)，當(dāng)LRR 結(jié)構(gòu)域識(shí)別各種刺激后(PAMPs 和DAMPs)可使NLRP3 發(fā)生寡聚化[8]。(2)連接蛋白含半胱氨酸蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-like protein containing a caspase ectuitment domain，ASC)：主要由兩部分組成，包括碳末端的半胱氨酸蛋白水解酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase activation and recruitment domain，CARD)氨基末端嘧啶結(jié)構(gòu)域(PYD)。NLRP3 與ASC 的嘧啶結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合引發(fā)炎性體的組裝后，ASC 與Caspase-1 的半胱氨酸蛋白水解酶募集結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合，至此，NLRP3 完成炎性體的組裝，促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的激活[9]。(3)效應(yīng)蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶前體(cysteine aspartate specific protease-1 precursor，pro-caspase-1)：當(dāng)NLRP3 炎性體完成組裝后，效應(yīng)蛋白pro-caspase-1 通過自身酶解作用形成具有生物活性的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate specific protease-1，Caspase-1)，后者再將白介素 1β (interleukin 1β，IL-1β)和白介素 18 (interleukin 18，IL-18)的前體剪切成熟并分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[10]。

2 NLRP3炎性體的啟動(dòng)及激活

迄今為止，研究已經(jīng)證明了NLRP3炎性體可被多種多種物質(zhì)激活，病原體包括：各種細(xì)菌、真菌、病毒；內(nèi)源性物質(zhì)包括ATP、ROS(reactive oxygen sepsis)；外源性刺激物包括石棉、尼古丁等[11]。這些結(jié)構(gòu)上不同的分子觸發(fā)NLRP3 寡聚化和炎性體激活的機(jī)制目前尚不清楚，但效果非常強(qiáng)烈。如果激活的NLRP3炎性體持續(xù)上調(diào)未被下調(diào)，則NLRP3炎性體將持續(xù)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致多種疾病，包括膿毒癥、阿爾茨海默病、與低溫蛋白相關(guān)的周期性綜合征、糖尿病和多種自身炎癥性疾病等[12-13]。NLRP3炎性體的激活主要受雙信號(hào)模型調(diào)控[14]。啟動(dòng)信號(hào)是由Toll樣受體識(shí)別微生物成分或內(nèi)源性細(xì)胞因子，激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF-κB)，導(dǎo)致pro-IL-1β的表達(dá)增加以及NLRP3 mRNA表達(dá)上調(diào)并啟動(dòng)NLRP3炎性體。激活信號(hào)由各種PAMPs 和DAMPs 組成，使得核心蛋白NLRP3 活化，從而啟動(dòng)炎性體的組裝，NLRP3 炎性體被激活。雖然目前對(duì)NLRP3 炎性體活化的具體調(diào)控機(jī)制研究仍不完全，但是目前較為認(rèn)可的調(diào)控機(jī)制模型通常包括以下三種。(1)NLRP3炎性體活化的離子通道模型：K+外流、Na+內(nèi)流是細(xì)胞內(nèi)維持電解質(zhì)平衡的常見現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)K+是NLRP3 炎性體激活的觸發(fā)因素，細(xì)胞發(fā)揮作用所需要的ATP與細(xì)胞表面的P2X7 受體結(jié)合后[15]，可導(dǎo)致相關(guān)的離子通道開放，pannexin-1孔形成并允許K+從細(xì)胞內(nèi)大量外流。胞質(zhì)內(nèi)鉀離子的耗竭激活NLRP3炎性體后介導(dǎo)IL-1β的成熟和釋放，此外K+外流還導(dǎo)致Ca2+非依賴性磷脂酶A2的激活，從而促進(jìn)IL-1β成熟[16]。(2)NLRP3 炎性體活化的溶酶體破裂模型：各種PAMPs 和DAMPs 被細(xì)胞吞噬后，通過某些直接或間接的作用，將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶酶體破裂，組織蛋白酶B從胞質(zhì)內(nèi)釋放出來，最近的研究表明，細(xì)胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)誘導(dǎo)組織蛋白酶B的激活，有助于NLRP3炎性體的激活，并加速Caspase-1 依賴性pro-IL-1β剪切成熟過程[17]。(3)NLRP3炎性體活化的活性氧模型：多種內(nèi)源性與外源性的物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒和胞外的ATP等可介導(dǎo)NLRP3炎性體的活化，并且這些NLRP3炎性體激活劑均會(huì)觸發(fā)ROS的產(chǎn)生，或協(xié)同ROS共同發(fā)揮活化作用[18-19]。所以目前的研究認(rèn)為NLRP3激活的關(guān)鍵因素之一是ROS，ROS的生成減少及清除增多均會(huì)明顯降低Caspase-1 活性，IL-1β分泌減少[20]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)線粒體自噬缺失的細(xì)胞，活性氧的產(chǎn)生也會(huì)增加，NLRP3 炎性體的活化也會(huì)增強(qiáng)[21]。下面將重點(diǎn)闡述NLRP3炎性體活化的活性氧模型。

3 活性氧介導(dǎo)的NLRP3炎癥體的活化

眾所周知，ROS是機(jī)體氧化還原反應(yīng)的一種正常代謝產(chǎn)物，1961 年，Jensen 首先證明線粒體可產(chǎn)生ROS，而后隨著研究的不斷深入，才證實(shí)線粒體是ROS 的主要來源[22]。ROS 可以雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和增殖，并激活轉(zhuǎn)錄因子，以進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，ROS 和線粒體在NLRP3 炎癥小體激活中的作用仍有爭(zhēng)議。ROS 被認(rèn)為是NLRP3 炎性體激活的常見信號(hào)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)NLRP3 激動(dòng)劑均會(huì)誘導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生。已有的研究表明，NLRP3炎性體的配體之一硫氧還原蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)對(duì)ROS 敏感，其受體蛋白為氧化還原酶硫氧還原蛋白(thioredoxin，TRX)。在正常條件下，機(jī)體內(nèi)的TXNIP 與TRX 結(jié)合形成復(fù)合物并處于靜息狀態(tài)。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，各種PAMPs 和DAMPs 刺激引起ROS濃度增加，復(fù)合物TXNIP-TRX解離，TXNIP與核心蛋白NLRP3 的LRR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可使NLRP3 發(fā)生寡聚化，激活NLRP3 炎性體[19]，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。線粒體呼吸鏈中的NADPH氧化酶最初被認(rèn)為是ROS產(chǎn)生的來源[23]。NADPH氧化酶4(NOX4)可調(diào)節(jié)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A (Carnitine palmitoyl transferase1A，CPT1A)并導(dǎo)致脂肪酸氧化增加，這有助于NLRP3 炎性體活化[24]。最近的一項(xiàng)研究表明，在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，NADPH 氧化酶2(NOX2)的缺失降低了NLRP3 炎性體的表達(dá)，并擾亂了缺血性卒中后小鼠大腦皮層中NLRP3-TXNIP的相互作用，但這一現(xiàn)象并不出現(xiàn)于該模型的臍靜脈內(nèi)皮中，這表明ROS 在NLRP3炎性體激活中具有組織特異性作用[25]。然而，一些研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體活化在小鼠和人類細(xì)胞中都不受NADPH 氧化酶的遺傳或藥理學(xué)抑制的影響[26]。線粒體 ROS (mitochondria ROS，mtROS)在 NLRP3 炎性體激活中的作用最初是從一項(xiàng)研究中提出的，該研究表明通過線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的mtROS 可以激活NLRP3 炎癥小體[27]。同樣，NAKAHIRA 等[28]發(fā)現(xiàn)，由功能失調(diào)的線粒體產(chǎn)生的mtROS 是NLRP3 炎性體激活所必需的，并且線粒體DNA(mitochondriaDNA，mtDNA)以NLRP3 和mtROS 依賴性方式釋放到細(xì)胞質(zhì)中。SHIMADA等[29]后來發(fā)現(xiàn)，雖然mtDNA與NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)相互作用，但氧化的mtDNA 才是NLRP3 炎性體激活所特別需要的。同樣，ZHONG 等[30]的研究也指出，由各種刺激因素誘導(dǎo)合成的氧化型mtDNA是NLRP3炎性體激活所必需的。綜上所述，這些研究表明在NLRP3 炎性體激活過程中，線粒體功能障礙、mtROS 和mtDNA起重要作用。然而，也有研究質(zhì)疑mtROS和線粒體功能障礙在NLRP3 炎癥小體激活中的作用[31-32]。值得注意的是，在這些研究中大多數(shù)都使用高濃度的化學(xué)抑制劑來抑制mtROS 的產(chǎn)生和線粒體功能，這很容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。并且至少有一項(xiàng)研究報(bào)告指出，ROS抑制劑還阻斷了NLRP3炎性體激活的啟動(dòng)信號(hào)[31]。除了 mtROS 和 mtDNA 的產(chǎn)生外，NLRP3 炎性體可與線粒體的各種分子相互作用(包括線粒體抗病毒信號(hào)蛋白、線粒體融合蛋白2 和心磷脂)，促進(jìn)其活化。例如MAVS 在病毒感染的情況下將核心蛋白NLRP3 募集到ASC，后者泛素化并促進(jìn)NLRP3 寡聚化，促進(jìn)了NLRP3 炎性體活化[33]。NLRP3 還被證明在病毒感染期間與線粒體線粒體融合蛋白2 直接相關(guān)[34]。心磷脂是線粒體內(nèi)膜的一種脂質(zhì)，直接與NLRP3 的LRR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，若干擾心磷脂表達(dá)，不利于NLRP3 炎性體激活[35]。此外，線粒體自噬也參與NLRP3炎性體的活化，當(dāng)線粒體自噬功能出現(xiàn)異常時(shí)，大量的線粒體活性氧累積，導(dǎo)致線粒體損傷，在沒有其他炎性體激活劑的情況下活化NLRP3 炎性體[18-36]，這與線粒體功能紊亂有關(guān)，為活性氧的間接作用。線粒體活性氧作為NLRP3炎性體活化的關(guān)鍵因素之一，在膿毒癥的調(diào)控中具有重要意義，針對(duì)線粒體活性氧活化NLRP3炎性體的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，對(duì)各類感染性疾病，尤其是膿毒癥的治療提供治療思路。

4 展望

炎癥是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，在有些情況下，炎癥發(fā)生時(shí)產(chǎn)生的過量的炎癥介質(zhì)破壞機(jī)體的免疫功能，從而引起多器官功能障礙，即出現(xiàn)膿毒癥，研究炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)并進(jìn)行拮抗是目前研究的方向。NLRP3 炎性體作為目前研究最為廣泛的炎性體，對(duì)于機(jī)體的炎癥調(diào)控至關(guān)重要。雖然目前對(duì)NLRP3炎性小體的激活調(diào)節(jié)機(jī)制并沒有研究透徹，但是眾多研究表明，NLRP3炎性體活化的關(guān)鍵因素之一是活性氧，而活性氧的主要來源是線粒體。線粒體通過產(chǎn)生ROS 或通過與NLRP3 炎性體的成分相互作用參與NLRP3 炎性體激活及下游的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究ROS 介導(dǎo)的膿毒癥NLRP3 炎性體的激活、調(diào)控機(jī)制，為膿毒癥治療提供新理論、新方法、新的治療靶點(diǎn)，有利于開發(fā)新的治療性抗炎藥。