基于miR-320/E2F轉(zhuǎn)錄因子1軸探討天南星提取物對肺癌細(xì)胞順鉑耐藥的影響及相關(guān)機(jī)制

劉雪嬌，張雪云，張勇

肺癌是臨床常見的癌癥類型，其好發(fā)于40歲及以上人群，以惡性程度高、侵襲及轉(zhuǎn)移性強(qiáng)為主要特征［1］。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球超過1/3的肺癌患者在我國，且近年我國肺癌發(fā)病率有持續(xù)增長趨勢，每年因肺癌死亡人數(shù)超過60萬，其已成為我國癌癥發(fā)病及死亡的首要原因［2］。肺癌早期常以手術(shù)切除為主要治療方案，手術(shù)切除原發(fā)病灶可達(dá)到臨床治愈或縮小腫瘤體積的目的；肺癌中晚期及轉(zhuǎn)移患者標(biāo)準(zhǔn)治療方案則是以順鉑為基礎(chǔ)的兩種聯(lián)合化療方案，其可明顯延長患者生存期，但長期使用順鉑會引發(fā)腫瘤耐藥，進(jìn)而影響化療效果［3］。天南星提取物是中藥天南星的主要活性成分集合物，具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、止痛、抗氧化等多重藥理活性，近年其被發(fā)現(xiàn)有一定抗腫瘤活性［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，天南星提取物可抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，從而對胃癌大鼠發(fā)揮治療作用［5］。但目前關(guān)于天南星提取物對肺癌細(xì)胞順鉑耐藥的影響及相關(guān)機(jī)制鮮有報道。本研究采用天南星提取物干預(yù)肺癌細(xì)胞，觀察其對順鉑耐藥的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 本實(shí)驗(yàn)時間為2020年9月至2021年6月。人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞系、人支氣管上皮16HBE細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 天南星提取物（蘭州沃特萊斯生物科技有限公司），qRT-PCR試劑盒、LipofectamineTM3000試劑盒、miR-320抑制質(zhì)粒、雙熒光素酶檢測試劑盒、MTT試劑盒購自上海群己生物科技有限公司，兔抗人E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）一抗購自美國CST公司，7300 qRT-PCR儀購自美國ABI公司，Spark酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 分別將A549/DDP細(xì)胞、16HBE細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10% FBS、1%青鏈霉素）中，在培養(yǎng)箱標(biāo)準(zhǔn)條件下（37 ℃，5% CO2）培養(yǎng)，A549/DDP細(xì)胞額外加入順鉑（終濃度為1 mg/L），隔天換液，待細(xì)胞融合至80%，胰酶消化后傳代培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 轉(zhuǎn)染及分組［6］取對數(shù)期A549/DDP細(xì)胞分為空白組和天南星組，空白組置于RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，天南星組置于加入天南星提取物（終濃度為8 mg/ml）的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。另取對數(shù)期A549/DDP細(xì)胞，PBS洗滌，胰酶消化重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，接種至6孔板，待細(xì)胞融合至80%，根據(jù)LipofectamineTM3000試劑盒說明書操作轉(zhuǎn)染步驟，將miR-320抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞，隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組，轉(zhuǎn)染組置于RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組置于加入天南星提取物（終濃度為8 mg/ml）的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每組細(xì)胞設(shè)置5個復(fù)孔。

1.5 qRT-PCR檢測miR-320相對表達(dá)量 分別取對數(shù)期A549/DDP細(xì)胞、16HBE細(xì)胞，經(jīng)Trizol法提取總RNA，采用Promega試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，定量后按照qRT-PCR試劑盒說明書要求設(shè)定反應(yīng)體系：雙倍核酸染料12 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μl，cDNA 1 μl，加雙蒸水至總體積為20 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，重復(fù)35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-320相對表達(dá)量。miR-320上游引物：5'-TCCTTTTTCGCCCTCTCAAC-3'，下游引物：5'-CTCCCCTCCGCCTTCTCTT-3'；U6上游引物：5'-GAATCGGGCCTGCTCAAGT-3'，下游引物：5'-CGAAACGGAGACCCAGGAAA-3'。培養(yǎng)48 h后，分別取空白組、天南星組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組細(xì)胞，檢測miR-320相對表達(dá)量，方法同上。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50） 培養(yǎng)48 h后，分別取空白組、天南星組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組細(xì)胞，PBS洗滌，胰酶消化重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，接種至6孔板，待細(xì)胞融合至80%，分別加入不同濃度（2、4、8、16、32 μg/ml）順鉑至RPMI 1640培養(yǎng)基中，干預(yù)48 h后加入MTT溶液（20 μl/孔，5.00 g/L），靜置2 h，吸去上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl/孔，振蕩至結(jié)晶溶解，采用酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm位置吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=（1-觀察孔吸光度值/對照孔吸光度值）×100%。繪制折線圖以計算順鉑對各組細(xì)胞IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 培養(yǎng)48 h后，分別取空白組、天南星組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組細(xì)胞，PBS洗滌，胰酶消化重懸，低溫離心10 min（3 000 r/min，離心半徑8 cm），吸去上清，根據(jù)Annexin V-APC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作實(shí)驗(yàn)步驟，采用binding buffer緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC、PI各5 μl并混勻，避光孵育10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.8 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-320與E2F1的靶向關(guān)系 經(jīng)靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan預(yù)測，E2F1 3'UTR可能存在與miR-320結(jié)合的位點(diǎn)，鑒定工作在上海群己生物科技有限公司進(jìn)行。分別構(gòu)建E2F1野生型和突變型3'UTR，并將其命名為E2F1 3'-UTR-WT、E2F1 3'-UTR-MT，分別插入至雙熒光素酶載體，與miR-320質(zhì)粒（miR-320 mimic-NC、miR-320 mimic）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，分為作為E2F1 3'-UTRWT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTR-WT+miR-320 mimic組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTRMT+miR-320 mimic組。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，經(jīng)雙熒光素酶檢測試劑盒測定各組熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性，相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.9 Western blotting法檢測E2F1蛋白相對表達(dá)量 培養(yǎng)48 h后，分別取空白組、天南星組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組細(xì)胞，采用RIPA液裂解細(xì)胞，低溫離心15 min（10 000 r/min，離心半徑10 cm），經(jīng)BCA試劑盒測定總蛋白。取40 μg樣本蛋白，與上樣緩沖液等比例混合，沸水浴變性蛋白，同參數(shù)離心取上清液，行凝膠電泳分離、濕法轉(zhuǎn)膜，采用BSA液封閉2 h，加入兔抗人E2F1一抗（1∶500），4 ℃冰箱冷藏過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，浸入ECL發(fā)光液發(fā)光，置于暗室顯色，經(jīng)凝膠成像儀拍照分析，并計算E2F1蛋白相對表達(dá)量，E2F1蛋白相對表達(dá)量=E2F1蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系miR-320相對表達(dá)量比較 16HBE細(xì)胞系miR-320相對表達(dá)量為（0.93±0.10），高于A549/DDP細(xì)胞系的（0.28±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.921，P＜0.001）。

2.2 四組miR-320相對表達(dá)量比較 空白組miR-320相對表達(dá)量為（0.27±0.02），天南星組為（1.57±0.09），轉(zhuǎn)染組為（0.11±0.01），轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組為（0.49±0.06）。四組miR-320相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=711.257，P＜0.001）。與空白組比較，天南星組miR-320相對表達(dá)量升高，轉(zhuǎn)染組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為31.530、16.000，P值均＜0.001）；與天南星組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組miR-320相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.326，P＜0.001）；與轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組miR-320相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.969，P＜0.001）。

2.3 四組細(xì)胞增殖抑制率、IC50及細(xì)胞凋亡率比較 四組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率、IC50及細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與空白組比較，天南星組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高、IC50降低，轉(zhuǎn)染組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低、IC50升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與天南星組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低，IC50升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高，IC50降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1～2。

圖1 四組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率變化的折線圖Figure 1 Broken line diagram of inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of cisplatin treatment among the four groups

圖2 四組流式細(xì)胞術(shù)檢測的細(xì)胞凋亡情況Figure 2 Apoptosis detected by flow cytometry among the four groups

表1 四組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率、IC50及細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of cisplatin treatment，IC50 and apoptosis rate among the four groups

表1 四組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率、IC50及細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of cisplatin treatment，IC50 and apoptosis rate among the four groups

注：IC50=半數(shù)抑制濃度；a表示與空白組比較，P＜0.05；b表示與天南星組比較，P＜0.05；c表示與轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05

組別細(xì)胞增殖抑制率（%） IC50（μg/ml）細(xì)胞凋亡率（%）2 μg/ml順鉑處理 4 μg/ml順鉑處理 8 μg/ml順鉑處理 16 μg/ml順鉑處理 32 μg/ml順鉑處理空白組 16.45±2.02 33.47±3.40 46.64±4.66 52.38±7.26 65.16±7.09 12.05±2.61 4.01±0.26天南星組 36.14±3.65a 58.02±6.69a 69.90±8.39a 79.58±8.36a 88.53±7.63a 3.38±0.48a 37.56±5.05a轉(zhuǎn)染組 8.78±1.05a 19.23±2.66a 28.98±3.55a 39.84±4.86a 53.62±6.23a 29.54±4.02a 1.77±0.18a轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組 20.20±2.57bc 44.64±3.33bc 53.61±6.42bc 64.45±3.04bc 76.96±7.67bc 6.47±0.80bc12.91±1.88bc F值 105.777 72.941 39.380 37.058 21.960 144.522 184.330 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四組雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E2F1 3'-UTR-WT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTRWT+miR-320 mimic組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic組相對熒光素酶活性分別為（1.30±0.14）、（1.29±0.15）、（1.30±0.15）、（0.92±0.11）。與E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic組比較，E2F1 3'-UTR-WT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTRWT+miR-320 mimic組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic-NC組相對熒光素酶活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為4.772、4.448、4.568，P值均＜0.05）。E2F1是miR-320的一個靶基因，兩者結(jié)合位點(diǎn)為E2F1的3'-UTR片段，見圖3。

圖3 生物信息學(xué)分析結(jié)果Figure 3 Bioinformatics analysis results

2.5 四組E2F1蛋白相對表達(dá)量比較 空白組、天南星組、轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組E2F1蛋白相對表達(dá)量分別為（0.27±0.04）、（0.13±0.01）、（0.88±0.10）、（0.72±0.07）。四組E2F1蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=153.655，P＜0.001）；與空白組比較，天南星組E2F1蛋白相對表達(dá)量降低，轉(zhuǎn)染組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為7.593、13.664，P值均＜0.001）；與天南星組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組E2F1蛋白相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=18.657，P＜0.001）；與轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組E2F1蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.931，P=0.019），見圖4。

圖4 Western blotting法檢測四組E2F1蛋白相對表達(dá)量的凝膠電泳圖Figure 4 Gel electrophoresis map of the relative expression of E2F1 protein among the four groups detected by Western blotting

3 討論

肺癌是發(fā)源于支氣管黏膜上皮組織的肺原發(fā)性惡性腫瘤，起初沿主支氣管壁或段支氣管壁浸潤生長，后向周圍肺組織擴(kuò)張，繼續(xù)沖擊臟層胸膜并擴(kuò)散到胸壁、膈肌，最終通過肺部各淋巴結(jié)及上腔靜脈轉(zhuǎn)移至腦、肝、腎等全身各處器官［7］。吸煙是肺癌的主要危險因素之一，此外，職業(yè)環(huán)境、電離輻射、肺部疾病及遺傳等也是其重要影響因素［8］。肺癌早期常表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀，以咳嗽、低熱、胸痛為主，后發(fā)展為咯血、面部水腫、聲嘶、消瘦，并隨著病灶遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移部位不同而伴有顱內(nèi)壓增高、肝腫大、腰痛等臨床表現(xiàn)［9］。肺癌多因癥狀不明而未能早期發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，此時化療是最有效的治療手段，其中順鉑是肺癌的一線化療藥物，其釋放的鉑離子可與細(xì)胞DNA鏈內(nèi)交聯(lián)，形成復(fù)合體，影響DNA復(fù)制，從而抑制癌細(xì)胞增殖，但癌細(xì)胞可降低順鉑吸收率、修復(fù)自身損傷DNA，從而產(chǎn)生耐藥性，影響化療效果［10］。因此，尋找可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞順鉑耐藥的藥物或手段對改善患者預(yù)后、降低病死率意義重大。

中醫(yī)治療肺癌具有獨(dú)特優(yōu)勢，肺癌歸于中醫(yī)學(xué)“肺積”“息賁”“肺萎”“咯血”等范疇，為五積之一，其主要病機(jī)為稟賦不足、情志失調(diào)、邪毒侵入、傷于肌表、由表入里、血行不暢、瘀血阻滯，以致脾胃失職、聚濕生痰、痰聚于肺、肺行水失職，終因毒聚邪留、氣機(jī)紊亂、發(fā)為肺積，故治療應(yīng)以祛濕化痰、清肺健脾為主［11］。中藥天南星取自天南星科植物天南星、異葉天南星、東北天南星等塊莖，性溫，味苦、辛，歸肺、肝、脾經(jīng)，可化痰、散結(jié)、燥濕、消腫［12］?！侗窘?jīng)逢原》［13］中記載，天南星可治寒熱、結(jié)氣、利胸膈，治積聚伏梁、破堅積。天南星提取物含有植物多糖、生物堿類、黃酮類、脂肪酸類等多種天然化合物，有研究表明其與半夏配伍可抑制腫瘤血管生成、降低肺癌細(xì)胞耐藥性、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，提示其對肺癌具有潛在治療作用［14］。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，天南星組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高、IC50降低，轉(zhuǎn)染組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低、IC50升高；與天南星組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率降低，IC50升高；與轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染組聯(lián)合天南星不同濃度順鉑處理后細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率升高，IC50降低，提示天南星提取物可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞順鉑耐藥，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與天南星提取物調(diào)控miR-320有關(guān)。

miRNA是細(xì)胞內(nèi)重要的非編碼調(diào)控因子，可調(diào)控眾多基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄，范圍涉及機(jī)體的整個生命過程，且因數(shù)量及分子量少，常被作為腫瘤耐藥及預(yù)后評估的特異性分子標(biāo)志物。miR-320是新發(fā)現(xiàn)的保守型miRNA，其在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，作為一種抑癌因子在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演著重要角色［15］。E2F1是E2F家族轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有額外細(xì)胞周期蛋白結(jié)合域，可改變細(xì)胞周期，調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高細(xì)胞侵襲、遷移能力，具有一定促癌作用［16］。劉延鋒等［17］研究表明，過表達(dá)miR-320可抑制E2F1基因表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞糖代謝，提示miR-320-E2F1軸在惡性腫瘤中具有一定作用。本研究結(jié)果顯示，與16HBE細(xì)胞系比較，A549/DDP細(xì)胞系miR-320相對表達(dá)量降低，提示miR-320在肺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-320與E2F1存在結(jié)合位點(diǎn)，E2F1是其靶向調(diào)控基因之一。本研究結(jié)果還顯示，與空白組比較，天南星組E2F1蛋白相對表達(dá)量降低，轉(zhuǎn)染組升高；與天南星組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組E2F1蛋白相對表達(dá)量升高；與轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染聯(lián)合天南星組E2F1蛋白相對表達(dá)量降低，提示天南星提取物逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞順鉑耐藥可能與調(diào)控miR-320，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因E2F1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，天南星提取物可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞順鉑耐藥，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與通過調(diào)控miR-320，進(jìn)而靶向下調(diào)E2F1表達(dá)有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：劉雪嬌進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；劉雪嬌、張雪云進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；劉雪嬌、張雪云、張勇進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；劉雪嬌、張勇進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；張雪云負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。