基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的北豆根治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

張科，宋崟，李波，谷冬梅，李正翔，袁恒杰

作者單位：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，a藥劑科，b檢驗(yàn)科，天津 300052

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative Colitis，UC）是一種病情復(fù)雜，病程較長(zhǎng)，主要累及結(jié)腸的非特異性炎癥反應(yīng)疾病，臨床很難根治［1］。目前治療以藥物治療為主，常用藥物包括氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但治療效果并不理想，且存在明顯的不良反應(yīng)［2］。北豆根又名蝙蝠葛根，為防己科植物蝙蝠葛（Menispermum dauricum DC.）的干燥根莖［3］，其性寒味苦，有小毒，歸大腸、胃、肺經(jīng)，具有祛風(fēng)止痛和清熱解毒等功效，常用于咽喉腫痛、熱毒瀉痢、風(fēng)濕痹痛等疾病的治療［4］。臨床很多含有北豆根的中藥方劑，對(duì)腸炎都有一定療效。相關(guān)試驗(yàn)也證實(shí)：北豆根單味藥原液，可以通過降低IL-6、MMP 和VEGF 水平發(fā)揮對(duì)UC 模型大鼠的治療作用［2］；近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)展迅速，該方法可以全面、系統(tǒng)對(duì)中藥多成分、多靶點(diǎn)作用機(jī)制進(jìn)行闡釋［5］。本研究擬采用該方法探究北豆根治療UC 的作用機(jī)制，為其在臨床研究提供依據(jù)。

1 方法

1.1 北豆根化學(xué)成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的收集與篩選打開TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以“北豆根”為關(guān)鍵詞檢索，收集藥材的化學(xué)成分?？诜锢枚龋∣B）是指藥物經(jīng)血管外途徑給藥后吸收進(jìn)入全身血液循環(huán)的相對(duì)量，其與藥物療效密切相關(guān)。藥物相似性（DL）指化合物與已知藥物的相似性，DL高的的化合物并不是藥物，但具有成為藥物的可能。研究顯示：藥物研發(fā)過程中OB 和DL 的好壞是決定目標(biāo)分子是否篩選進(jìn)入研究下一步的關(guān)鍵參數(shù)［6］。本研究以O(shè)B≥30%和DL≥0.18［7］為條件篩選有效成分；最后，收集數(shù)據(jù)庫中成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。打開Uniprot 數(shù)據(jù)庫，選擇UniprotKB ，輸入檢索式為“reviewed：yes AND organism：Homo sapiens（Human）”進(jìn)行檢索，獲得20394 條人類的相關(guān)靶蛋白及對(duì)應(yīng)基因的信息，以Excel 格式導(dǎo)出，再使用“VLOOKUP”函數(shù)進(jìn)行匹配，將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換便于分析的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 UC 治療靶點(diǎn)的篩選 打開Genecards 數(shù)據(jù)庫，以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞檢索，收集UC 疾病靶點(diǎn)，以Excel 格式導(dǎo)出，然后將“1.1”節(jié)中北豆根的成分靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因與疾病靶點(diǎn)基因取交集。

1.3 “藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將藥物、有效成分和交集基因數(shù)據(jù)處理后，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件中繪制“藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中不同類型節(jié)點(diǎn)分別代表北豆根、有效成分和靶點(diǎn)，邊代表三者之間的關(guān)系。然后對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，再根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）和介數(shù)中心性（Betweenness Centrality，BC）對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行調(diào)整，節(jié)點(diǎn)的大小反映Degree 的大小，邊的粗細(xì)反映BC的大?。?］。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選 將“1.2”節(jié)的交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫繪制蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI），將分析數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出，導(dǎo)入Cytoscape3.2.1 軟件，繪制北豆根與UC 靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析；再利用“Generate style from statistics”工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色進(jìn)行設(shè)置。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表Degree 值的大小，邊的粗細(xì)反映了Combine Score 的大小，從中篩選出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5 基因功能注釋分析和功能富集分析 將1.2節(jié)的交集基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫，并限定物種為人，進(jìn)行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，對(duì)生物過程（P＜0.01）和信號(hào)通路（P＜0.05）進(jìn)行篩選，并進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 北豆根有效成分及靶點(diǎn)的確定 檢索得到北豆根化學(xué)成分31 個(gè)，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為條件篩選出有效成分10 個(gè)，包括蝙蝠葛堿、葉含去羥尖防己堿、蝙蝠葛辛堿、山豆根堿、山豆根波芬諾靈堿、漢防己堿、光千金藤堿、光千金藤定堿、北豆根堿、碎葉紫堇堿，具體信息見表1。檢索得到10個(gè)成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)175個(gè)：蝙蝠葛堿作用靶點(diǎn)2個(gè)，葉含去羥尖防己堿作用靶點(diǎn)2 個(gè)，蝙蝠葛辛堿作用靶點(diǎn)26個(gè)，山豆根波芬諾靈堿作用靶點(diǎn)24 個(gè)，漢防己堿作用靶點(diǎn)25 個(gè)，光千金藤堿作用靶點(diǎn)27 個(gè)，光千金藤定堿作用靶點(diǎn)30 個(gè)，北豆根堿作用靶點(diǎn)10 個(gè)，碎葉紫堇堿作用靶點(diǎn)29個(gè)，山豆根堿沒有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。將所得靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名，刪除重復(fù)和無效靶點(diǎn)，共獲取北豆根活性成分作用靶點(diǎn)78個(gè)。

表1 北豆根中10個(gè)有效成分的基本信息

2.2 UC 治療靶點(diǎn)的篩選結(jié)果 Genecards 數(shù)據(jù)庫檢索到UC 疾病靶點(diǎn)3982 個(gè)，將北豆根有效成分靶點(diǎn)和UC 疾病靶點(diǎn)取交集，得到交集基因44個(gè)，作為北豆根治療UC 的“關(guān)鍵靶點(diǎn)”，見圖1。

2.3 “藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果“藥物-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖共包括55 個(gè)節(jié)點(diǎn)（1 個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，10 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、44 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和229 條邊，見圖2。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治鲲@示：蝙蝠葛辛堿、山豆根波芬諾靈堿、漢防己堿、光千金藤堿、光千金藤定堿、北豆根堿能與9個(gè)以上的靶點(diǎn)相連接，推測(cè)這6個(gè)成分是北豆根治療UC的主要有效成分。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的分析 PPI 網(wǎng)絡(luò)包含43 個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中HPSE 靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)沒有連接關(guān)系）和260 條邊，平均節(jié)點(diǎn)Degree 值為11.8。該網(wǎng)絡(luò)中度值（Degree）排名前10 的靶點(diǎn)包括：IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2。將PPI 網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)從STRING 數(shù)據(jù)庫中以TSV 格式導(dǎo)出，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件中，繪制北豆根與UC靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

2.5 功能注釋分析和功能富集分析結(jié)果 北豆根治療UC 的“關(guān)鍵靶點(diǎn)”共在97 個(gè)（P＜0.01）GO term上富集，其中生物過程（BP）66 個(gè)，分子功能（CC）9個(gè)，細(xì)胞組成（MF）22 個(gè)。BP、CC、MF 的COUNT 得分排名前9 的分析結(jié)果如圖4 所示，主要涉及的生物學(xué)功能與過程包括：細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及藥物反應(yīng)等；北豆根治療UC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)共富集在62 條（P＜0.05）通路上，主要通過調(diào)控TNF、PI3K-Akt 、T 細(xì)胞受體等信號(hào)通路發(fā)揮作用，如圖5所示。

3 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)北豆根治療UC的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：從北豆根31 個(gè)已知化學(xué)成分中共篩選獲得有效成分10個(gè)，北豆根和UC 的交集靶基因有44個(gè)，進(jìn)一步探究了北豆根治療UC 的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)涉及的生物過程包括：炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖正向調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)以及藥物反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的負(fù)向調(diào)控、缺氧反應(yīng)、NO 生物合成過程的正向調(diào)控等；分子功能包括：酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、轉(zhuǎn)錄因子活性序列特異性DNA 結(jié)合、序列特異性DNA 結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性等，這些與UC 的發(fā)生和發(fā)展都有一定的聯(lián)系。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2 等靶點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)，推測(cè)它們是北豆根治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)?，F(xiàn)代研究表明IL-6 在UC 的發(fā)病過程中起著重要的作用，它的過度表達(dá)會(huì)使腸上皮細(xì)胞通透性增加，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞的分泌、增殖、溢出并浸潤(rùn)至炎癥部位，誘發(fā)或加重UC［9-12］。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)62 條通路與UC 的發(fā)病相關(guān)，主要包括：TNF 通路、PI3K-Akt 通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等。研究顯示：介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和自噬的PI3K-Akt 信號(hào)通路［13］，活化后可上調(diào)腸黏膜p-Akt 表達(dá)［14］，激活核轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)TNF-α、IL-6等促炎因子的轉(zhuǎn)錄水平，誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致組織損傷［15］，同時(shí)研究表明UC 相關(guān)的癌變與過度活化的PI3K-Akt信號(hào)通路有密切聯(lián)系［16-17］。

綜上，北豆根可能通過IL6、TNF、MYC、CASP3、MAPK14、PTGS2、NOS3、ESR1、RELA、MMP2 等靶點(diǎn)調(diào)控調(diào)控TNF 通路、PI3K-Akt 通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等通路，進(jìn)而對(duì)消化、免疫等系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)，抑制UC 炎癥損傷。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，不僅能有效闡明多成分中藥的藥理作用機(jī)制，還能揭示其作用靶點(diǎn)與關(guān)鍵信號(hào)通路，為中藥藥理和作用機(jī)制研究提供新的思路與方法，從而促進(jìn)傳統(tǒng)中藥的應(yīng)用。但是該方法也存在一定局限，其研究結(jié)論主要著眼于藥材中的已知成分、靶點(diǎn)和通路，而容易忽略了可能存在的未知成分和非核心靶點(diǎn)和通路的作用；雖能預(yù)測(cè)發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，但無法獲知靶點(diǎn)的上調(diào)或下調(diào)，無法預(yù)測(cè)其功能改變的方向；同時(shí)也不能體現(xiàn)中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)制的影響。因此，需要進(jìn)一步的體內(nèi)外試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)的結(jié)果，才能更加準(zhǔn)確、客觀地闡釋中藥的藥理作用機(jī)制。

（本文圖1～5見封三）